Abstract
The biocontrol potential of eight strains of Metarhizium anisopliae was evaluated for the cattle tick Boophilus microplus under laboratory and field conditions. The strain 137bm caused the highest effect on the reproductive capacity of the tick, decreasing tick oviposition by 90 and 96% when adult ticks were treated in vitro with 1x108 and 1x109 conidia/ ml. It also reduced egg viability by more than 98% in the same doses. In the field trials it was possible to reduce tick infestation by 75% in Holstein x Cebú cows when M. anisopliae 137bm was applied at a concentration of 1x108 conidias/ ml. Also, the fecundity of the ticks coming from cows treated with M. anisopliae was three times lower than that of the control group. On the other hand, strain 137bm applied to the meadow at a concentration of 5x1012 conidia/ha concentration caused a decrease in the larval tick population close to 86% one week after an application with conidia of M. anisopliae.
Introducción
La garrapata Boophilus microplus (Canestrini, 1887) es considerada como uno de los más importantes ectoparásitos del ganado bovino en los países tropicales debido a los daños directos que ocasiona y a los agentes infecciosos que transmite y que causan enfermedades como anaplasmosis y babesiosis (da Guedes et al. 2000; Costa et al. 2002). Las garrapatas se encuentran distribuidas en diferentes zonas en todo el mundo pero es principalmente en Centro y Sur América y el occidente de África donde generan las más grandes pérdidas económicas, que en años anteriores fueron calculadas entre US$ 13.900 y 18.700 millones debido a que causan disminución en la producción de leche y carne, mortalidad del ganado, sin considerar el costo derivado de su control (Bittencourt et al. 1997; Kaaya y Asan 2000).
El control de las garrapatas se realiza comúnmente mediante acaricidas, pero por el desarrollo de resistencia (Rodriguez-Vivas et al. 2006), por la demanda de alimentos libres de residuos químicos y por el cuidado del ambiente, se sugiere la utilización de sistemas alternativos de control entre los que se pueden contar el empleo de nemátodos (Hill 1998), vacunas (Jonsson et al. 2000; Ruiz et al. 2007), bacterias (Hassanain et al. 1997), aceites esenciales (Prates et al. 1998) y hongos entomopatógenos como Beauveria bassiana (Bals. Vuill, 1806) y Metarhizium anisopliae (Metschnikoff, 1879, Sorokin, 1883). Se ha reportado que estos hongos causan mortalidad en garrapatas adultas, a la vez que disminuyen su fecundidad (Bittencourt et al. 1997; Zhioua et al. 1997; Barcelos et al. 1998; Kaaya 2000; Guedes et al. 2000; Kaaya y Asan 2000; Benjamín et al. 2002; da Costa et al. 2002).
M. anisopliae es un hongo Deuteromycete, patógeno generalista que ataca un diverso grupo de insectos (Benjamín et al. 2002; Quesada-Moraga et al. 2004). Este hongo invade el cuerpo del artrópodo hospedero a través de la cutícula y posteriormente se reproduce en él, favoreciendo así la transmisión horizontal del hongo y además puede tener efecto sobre la reproducción del organismo que está siendo atacado (Quesada-Moraga et al. 2004). M. anisopliae ha sido utilizado comúnmente para el control de insectos entre los que se destacan hormigas, termitas, langostas y cucarachas entre otros, y también se ha usado para el control de ácaros y garrapatas (Souza et al. 1999; Bittencourt 2000; Kaaya y Asan 2000; López y Orduz 2003).
El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto patógeno de M. anisopliae sobre diferentes estados de desarrollo de la garrapatas B. microplus mediante bioensayos en el laboratorio y pruebas en campo, utilizando ganado y pasto naturalmente infestados.
Materiales y Métodos
También se realizaron bioensayos con larvas de B. microplus obtenidas de teleoginas que se incubaron como se mencionó anteriormente. Las larvas se trataron con conidias de cada una de las cepas de M. anisopliae en un rango de concentración entre 10³ y 10⁹ conidias/ml. Se agregaron 3 ml de las suspensiones de conidias en cajas de petri con círculos de papel filtro. Posteriormente, se depositaron entre 300 y 500 larvas de 11 a 21 días de nacidas, se cubrieron con otro círculo de papel filtro y se agregaron nuevamente 3 ml de las suspensiones de conidias de M. anisopliae. Se incubaron por 3 min a temperatura ambiente y después las larvas se colocaron en tubos de ensayo cerrados con tapones de algodón e incubadas a 26°C, 85-90% de humedad por 10 días. Las larvas del grupo control se trataron con agua destilada estéril. Se evaluó la mortalidad larvaria de acuerdo con la técnica descrita por Souza et al. (1999) y Chagas et al. (2003).
En la prueba se utilizaron 20 vacas del cruce Holstein x Cebú distribuidas en dos grupos de 10 animales cada uno. Un grupo de vacas fue bañado con una suspensión acuosa de conidias de M. anisopliae cepa 137bm a una concentración de 1x10⁸ conidias/ml. Se aplicó 1 litro de la suspensión de conidias por cada 100 kg de peso del animal. El otro grupo de vacas sirvió como control y se utilizó solamente agua en la misma cantidad que el grupo tratado con el hongo. La elección de la dosis utilizada en estas pruebas se hizo teniendo en cuenta los buenos resultados con esta concentración en pruebas de laboratorio y por el costo del tratamiento de un producto comercial.
Las aplicaciones se hicieron en tres ocasiones con una bomba de aspersión, con intervalos de una semana y se continuó el monitoreo por tres semanas después de la última aplicación. El seguimiento del experimento se realizó mediante el recuento semanal de garrapatas adultas con un tamaño superior a 4 mm en cada uno de los animales. Después de 48 horas de las aplicaciones de M. anisopliae, de cada una de las vacas se recolectaron garrapatas que fueron llevadas al laboratorio para determinar el peso de los huevos ovipositados y el porcentaje de eclosión larvaria. Los especimenes recogidos se trataron de igual forma como se mencionó en los bioensayos en laboratorio.
El hongo M. anisopliae cepa 137bm se aplicó también en el pasto (pradera) en parcelas de 9 mβ con una dosis de 5x10¹β conidias/ha. Se utilizó un potrero distinto al experimento con vacas y libre de ganado. Las aplicaciones y evaluaciones se hicieron en las mismas fechas en que se hizo el experimento con los bovinos. Se determinó el número de larvas de garrapatas en las parcelas contabilizando las larvas que se adherían a una tela blanca de 1 mβ que se extendió sobre el pasto tres veces durante tres minutos en cada visita (Benjamín et al. 2002). Una parcela de igual tamaño que la anterior donde se aplicó solamente agua sirvió como control. Durante el período de observación no se permitió al ganado pastorear en esas parcelas.
Resultados
En los bioensayos con larvas de garrapata se encontró una alta susceptibilidad de las larvas a todas las cepas de M. anisopliae y se determinó que las cepas 81, 94, 95 y 136 fueron las más efectivas para matar larvas de garrapata y presentaron una concentración letal media (CL₅₀) en un rango entre 1,57x10⁴ y 6,33x10⁴ conidias/ml (Tabla 3).
Eficacia de Metarhizium anisopliae sobre la garrapata Boophilus microplus.
Los datos dentro de una columna y para cada índice seguidos de la misma letra no son significativamente diferentes (Tukey a = 0.05). n.d. = no determinado.
Porcentaje de eclosión de larvas de huevos procedentes de Boophilus microplus tratadas con diferentes cepas y dosis de Metarhizium anisopliae.
Los datos dentro de una columna seguidos de la misma letra no son significativamente diferentes (Tukey a = 0,05). n.d. = no determinado.
En el grupo de vacas control se presentó un aumento en la infestación de garrapatas durante el mismo periodo (Tabla 5). Además, la cepa 137bm M. anisopliae causó una disminución de oviposición y eclosión de larvas provenientes de vacas tratadas por lo que los valores de IPH y ER son de tres y dos veces menores que en el control, con diferencias estadísticamente significativas, después de la segunda y tercera aplicación del hongo, respectivamente (Tabla 5).
En el experimento en pasto el efecto biocontrolador de M. anisopliae fue menos notorio debido a que tanto en la parcela tratada como en el control hubo una disminución en la población de larvas garrapata durante el tiempo de evaluación. De manera que en la segunda semana del experimento en pasto, después de la primera aspersión con las conidias de M. anisopliae, se encontró una reducción del 87% de la población de larvas de garrapata (Tabla 4). Mientras que en el control solo se presentaron diferencias significativas respecto al recuento inicial, hasta cuatro semanas después de haber iniciado el experimento (Tabla 4).
Concentración letal media (CL₅₀) de diferentes cepas de Metarhizium anisopliae sobre larvas de garrapatas Boophilus microplus.
Promedio de garrapatas teleoginas (tamaño 4 a 8 mm) en las vacas y de larvas de garrapatas en el pasto con Metarhizium anisopliae cepa 137bm.
Las aplicaciones se hicieron en las semanas 1, 2 y 3.
= Los datos dentro de una columna seguidos de la misma letra no son significativamente diferentes (Tukey a = 0,05).
Parámetros para medir el efecto de Metarhizium anisopliae sobre Boophilus microplus colectadas de ganado tratado en las pruebas de campo.
Las aplicaciones se hicieron en las semanas 1, 2 y 3.
Índice de producción de huevos (IPH).
Eficiencia reproductivas (ER).
Los datos dentro de una columna seguidos de la misma letra no son significativamente diferentes (Tukey a = 0,05).
Discusión
M. anisopliae presentó una alta capacidad para atacar las garrapatas, puesto que aun en las concentraciones más bajas utilizadas afectó diferentes estados de desarrollo de este ectoparásito sobre los bovinos o en el pasto. Además, M. anisopliae causó disminución en la oviposición de garrapatas provenientes de vacas tratadas y en la eclosión larvaria, lo que podría ser interpretado como la transmisión vertical del efecto controlador del hongo a la descendencia del artrópodo. Resultados similares han sido demostrados en otros estudios de control de garrapatas (Bittencourt et al. 1994a, 1994b; Barcelos et al. 1998; Bittencourt 2000; Kaaya 2000; Guedes et al. 2000; Quesada-Moraga et al. 2004). El efecto de transmisión vertical de M. anisopliae ha sido estudiado en cucarachas, en las que se encontró disminución cercana al 50% en la producción de huevos y en la eclosión de ninfas cuando los adultos fueron tratados con la cepa EAMa01/121-Su (Quesada-Moraga et al. 2004).
Los resultados de laboratorio pudieron ser extrapolados a la prueba de campo que se realizó con la cepa 137bm, aunque los cambios en los resultados de IPH, ER y eclosión no tuvieron la misma intensidad de los ensayos de laboratorio posiblemente debido a que las conidias del hongo se vieron afectadas por condiciones ambientales como la intensidad solar y la lluvia.
M. anisopliae causó una disminución en la infestación de garrapatas en el ganado y en el pasto. Este efecto controlador de M. anisopliae sobre las garrapatas se conservó en el ganado tratado durante dos semanas después de la última aplicación. Resultados similares fueron observados en un trabajo previo donde el efecto de las conidias de los hongos B. bassiana y M. anisopliae persistieron entre una a tres semanas en las orejas del ganado después de la aplicación (Kaaya et al. 1996).
De acuerdo con los datos de IPH, ER y el porcentaje de eclosión larvaria, no se presentaron diferencias significativas entre el grupo de vacas tratadas y el control cuando se aplicó M. anisopliae la primera vez, pero después de la segunda y de la tercera aplicación del hongo sobre las vacas se encontró reducción de los parámetros en el grupo de animales tratados, situación que sugiere que una sola aplicación no es lo suficientemente efectiva, por lo que se deben realizar aplicaciones periódicas de hongos en un esquema similar al que se hace cuando se aplican productos químicos. Además, la aplicación de M. anisopliae también debe realizarse en el pasto donde se encuentran las larvas de garrapatas con el fin de disminuir la posibilidad de una nueva infestación en el ganado, ya que se conoce que las larvas son altamente susceptibles a la acción del hongo, como se logró comprobar en este trabajo.
A pesar de que en el experimento de campo en la parcela control hubo disminución en la población de garrapatas, ésta sólo presentó diferencias significativas respecto a la población inicial de larvas a partir de la cuarta semana del experimento mientras que en el lote tratado la disminución se dio una semana después. Además, el experimento de campo fue realizado durante octubre y noviembre de 2003 que estuvieron entre los meses más lluviosos del año con 202 y 156 mm, y 21 y 14 días de lluvia en el mes, respectivamente (Datos obtenidos del Instituto de Estudios Ambientales de Colombia IDEAM). Esta precipitación puede tener dos efectos, el primero es mantener una alta humedad en el ambiente lo que favorece la germinación de las conidias de M. anisopliae y promueve el proceso de infección (Luz y Fargues 1997), pero por otro lado puede causar disminución de la población de larvas del pasto por lavado, tendencia que se observó en el grupo control.
Footnotes
Agradecimientos
Este proyecto se desarrolló con el apoyo financiero de Colciencias, Corporación para Investigaciones Biológicas y la Empresa Colombiana de Productos Veterinarios, Vecol S.A.