Modification of A Standard Protocol for Dna Extraction from Smaller Sandflies (Phlebotominae: Lutzomyia)

Abstract

We evaluated the yield of a potassium acetate protocol with minor modifications for the extraction of genomic DNA. The results showed that using the modified protocol gave a higher DNA yield (0.61, and concentration 37.34 ng/µL) was obtained with respect to the original protocol. The amplification of DNA by PCR for mitochondrial regions demonstrated the high quality of this DNA for molecular population studies, in less time and cost, without the use of highly toxic reagents.

Introducción

En la extracción de ADN de muestras de flebotomíneos se han utilizado métodos basados en el uso de sales como acetato de potasio, en su forma convencional combinado con el deter- gente SDS, sodio lauril-sulfato (Ready et al. 1991; Parvizi y Amirkhami 2008), o en su forma modificada combinada con proteinasa K (Hodgkinson et al. 2003; Torgerson et al. 2003), el uso de la proteínasa K combinada con el método clorofor- mo-fenol (Michalsky et al. 2002; Kato et al. 2005); paquetes comerciales de extracción de ADN, DNeasy tissue kit de Qiagen (Beati et al. 2004), y el uso de la resina Chelex-100 (Cabrera et al. 2003; Jorquera et al. 2005).

Sin embargo, la talla corporal de los flebotomíneos, que representa la disponibilidad de tejido por muestra, a priori es una limitante, y en especial en estudios de variabilidad y genética poblacional espacio-temporal, en donde la cantidad de ADN aislado por muestra identificada es importante, en contraste con la cantidad extraída desde otros grupos de in- sectos, en especial vectores de importancia médica como mos- quitos ó triatóminos (Nordase et al. 2004; De Armas et al. 2005). La extracción de ADN de flebotomíneos individuales resulta en bajo rendimiento, efectividad, y en algunas ocasio- nes con baja pureza cuando se hacen extracciones extensivas, lo que requiere el uso de protocolos que mejoren el rendimien- to de ADN, como el empleo de paquetes comerciales.

Para los países latinoamericanos los estudios de genética molecular a nivel poblacional, implican una inversión muy alta, por los costos de importación de paquetes comerciales de ex- tracción y purificación de ADN y reactivos (sobre todo los reactivos tóxicos que necesitan fletes de importación especial) lo que limita su uso, y obliga a considerar los protocolos tradi- cionales. Por otro lado, los protocolos necesitan cumplir hoy en día con las normativas de seguridad laboral y ambiental por lo que apuntar al uso de reactivos no tóxicos y no contaminan- tes es ideal. En este sentido, el protocolo basado en precipita- ción con sales en su forma convencional es idóneo y ha sido empleado en estudios poblacionales, con distintas modifica- ciones desde los protocolos originales de Ish-Horowizh et al. (1982), Bender et al. (1983) y Collins et al. (1987) para la extrac- ción de ADN de especies del Viejo Mundo, Phlebotomus spp. y Sergentomyia spp. (Ready et al. 1991; Esseghir et al. 1997; Aransay et al. 1999; Parvizi y Amirkhami 2008), como en espe- cies del nuevo mundo Lutzomyia longipalpis (Lutz y Neiva 1912), L. pseudolongipalpis Arrivillaga y Feliciangeli, 2001, L. intermedia (Lutz y Neiva, 1912), L. withmani (Antunes y Coutinho, 1939) (Esseghir et al. 1997, Arrivillaga et al. 2003; Souza et al. 2007) con un alto rendimiento desde muestras preservadas en etanol 70% y secas.

Sin embargo, utilizando el método de sales, desde mues- tras de flebotomíneos con talla pequeña como, Lutzomyia youngi (Feliciangeli y Murillo 1987), L. evansi (Nuñez-Tovar, 1934), L. nunez tovari (Ortiz, 1954), L. spinicrassa Morales, Osorno de Osorno y Hoyos, 1970, L. trinidadensis (Newstead, 1922), L. cayenensis (Floch and Abonnenc, 1941), se logra la extracción de ADN (Testa et al. 2002; Vivero et al. 2007), pero la efectividad en las extracciones extensivas es del 10% (muestras preservadas en etanol) y 20% (muestras frescas), con rendimientos menores a 0,1, lo cual limita los estudios poblacionales. En la presente nota se señala una modificación del protocolo de Arrivillaga et al. (2003) en varios pasos con la finalidad de proporcionar un método ajustado a muestras de flebotomíneos de pequeña talla corporal para estudios poblacionales.

Materiales y Métodos

Muestras biológicas.

Se utilizaron en el estudio dos grupos de flebotomíneos para un total de 162 ejemplares de Lutzomyia youngi, recolectados en la localidad tipo, Las Calderas (09°22′N, 70°26′W), Estado de Trujillo, Venezuela. Los adultos fueron pesados individualmente (peso promedio de hembras 80,92 µg y en machos de 50,65 µg) y medida la longitud del ala derecha (promedio en hembras de 2,1 mm y en machos de 1,7 mm) para correlacionar la cantidad de tejido (peso o tamaño) en relación a la cantidad de ADN y al grado de pureza (relación de DO 260/280). Luego se realizó la disección de los ejemplares (hembras = montaje de cabezas y genitalia, machos = montaje de genitalia), las piezas fueron montadas en medio Berlese, para su fijación e identificación, utilizando la clave Young y Duncan (1994).

Extracción de ADN.

Un total de 34 ejemplares fueron usados para la extracción individual de ADN siguiendo el protocolo de Arrivillaga et al. 2003. Mientras, el resto de los ejemplares (n = 128) fueron homogenizados siguiendo como base este mismo protocolo con tres modificaciones menores que mejo- raron el rendimiento y pureza del ADN (Tabla 1). Los ejem- plares fueron homogeneizados con un triturador manual mar- ca Kontex en 50 µL de tampón de lisis (NaCl 0,1 M; sacarosa 0,2 M; EDTA 50 mM; tris-HCl 100 mM pH 8,25; SDS 0,05 %); incubando a una temperatura de 65°C por 120 min. La precipitación de proteínas se realizó con 14 µL de acetato de potasio 8 M, durante 60 min sobre hielo, seguido de una centrifugación a 14.000 rpm durante 15 min. ElADN se incubó a temperatura ambiente por 10 min, con 100 µL de etanol abso- luto, se centrifugó a 14.000 rpm por 15 min Se descartó el sobrenadante, se agregó 100 µL de etanol al 70%, y se incubó a -20°C por 24 horas. Posteriormente, se centrifugó la mezcla a 14.000 rpm durante 15 min y el precipitado se lavó dos veces con etanol (100%) por 10 min. Después de secar a temperatura ambiente, el ADN se resuspendió en 20 µL agua grado molecular y luego se conservó a - 20°C.

PCR de regiones mitocondriales y comparación.

El ADN extraído por ambos protocolos se amplificó en un volumen final de 25 µL de reacción con 4 µL de muestra de ADN, uti- lizando los cebadores para tres regiones mitocondriales (COI, ND5 y 12S) empleados por Arrivillaga et al. 2003. La detección del producto de PCR se visualizó en geles de agarosa al 1,2% en TBE 0,5X con bromuro de etidio 0,5 g/mL. Utilizando el programa Microsoft Excel 2007 se realizaron regresiones linea- les con los valores de la concentración de ADN en relación a las variables de peso del tejido muestra, grado de pureza (DO: 260/280) y longitudes del ala derecha.

Resultados y Discusión

La extracción de ADN con el protocolo de sales de potasio combinado con soluciones tapones, tales como TSE (Tris-SDS- EDTA) y etanol combina procesos químicos, físicos y mecá- nicos resumidos en tres pasos: lisis celular, eliminación de proteínas y precipitación y limpieza de ADN. Este método es económico, no maneja compuestos de alta toxicidad o con- taminantes del ambiente y se obtienen en promedio cantida- des significativas de ADN con alta pureza (Tabla 1). Las mo- dificaciones propuestas al protocolo de Arrivillaga et al. (2003) aunque son menores, garantizan una mayor efectividad (79% de positividad) en relación al número de muestras para la ex- tracción de ADN, con un rendimiento 1.000X más efectivo.

En contraste, el método de Arrivillaga et al. (2003) ha sido empleado en flebotomíneos de mayor talla corporal (Lutzomyia longipalpis) con fines de estudios poblacionales. Sin embar- go, no existe reporte de valores de rendimiento y concentra- ción de ADN para realizar comparaciones directas, a pesar que los autores señalan que el procesamiento es efectivo en aproximadamente 3.000 ejemplares, mediante la obtención de productos de PCR de buena calidad para su secuenciación.

En general, los trabajos a nivel molecular en flebotomíneos, y que emplean el método de sales para extracción de ADN, con fines taxonómicos o filogenia molecular (Ready et al. 1991, Esseghir et al. 1997, Aransay et al. 1999, Arrivillaga et al. 2003), no señalan las concentraciones o el grado de pureza del ADN extraído, por lo que no es posible realizar compa- raciones. Sin embargo, Vivero et al. (2007), señala un proto- colo modificado de Collins et al. (1987) para la extracción de ADN genómico, desde 512 individuos pertenecientes a siete especies de flebotomíneos neotropicales. Estos autores se- ñalan el uso del 40% v/v de la muestra de ADN resuspendida para la amplificación exitosa de regiones mitocondriales vía PCR (Fig. 1).

En comparación con el protocolo de Vivero et al. (2007), el protocolo propuesto en el presente trabajo tiene ciertas dife- rencias metodológicas de gran importancia, las cuales se resu- men a continuación: mayor tiempo de incubación en buffer de lisis (30 min. vs. 120 min.), mayor tiempo de precipitación en acetato de potasio (30 min. vs. 60 min.), mayor tiempo y veloci- dad de centrifugación para la sedimentación final del ADN (12 rpm/20 min. vs. 14 rpm/15 min.). En nuestro caso, las modifica- ciones resultan en un aumento del rendimiento de extracción de ADN, y solo se usa el 20% v/v de la muestra resuspendida de ADN para la amplificación de regiones mitocodriales, au- mentándose la efectividad de nuestro método en un 50% en comparación al utilizado por Viveros et al. (2007) en flebo- tomíneos.

Tabla 1.

Valores de las medias de concentración, grado de pureza y rendimiento para las dos protocolos empleados en la extracción de ADN genómico de Lutzomyia youngi. Los valores en paréntesis representa la desviación estándar.

Método de extracción	Paso	Duración Volumen	Peso (mg)	Concentración de ADN (µg/µL)	Pureza DO 260/280	Rendimiento
Arrivillaga 2002	Incubación en Baño	30 min.	0,07084	0,0000377	1,8467	0,0005
	Incubación en AcK	30 min.
	Centrifugación final	10 min.
Modificación	Incubación en Baño	120 min.	0,060753	0,03734	2,1567	0,612
	Incubación en acetato de potasio	60 min.
	Centrifugación final	15 min.

Figura 1.

Corridas electoforéticas en gel de agarosa al 1,2% de productos de amplificación de PCR para tres regiones mitocondriales. A. Citocromo oxidasa I (COI, 530 pb). B. NADH-5 (ND5, 450pb). C. 12S ribosomal (12S, 420 pb). La banda de 500 bp es señalada para el marcador de peso molecular de 100 bp utilizado en la electroforesis.

Nuestros resultados son comparables a los obtenidos por Michalsky et al. (2002), y Kato et al. (2005) quienes utilizan el protocolo de cloroformo fenol combinado con proteinasa K, en relación a que la alta calidad del ADN se demuestra con el uso de menor cantidad de volumen de ADN extraído para fines de amplificación vía PCR. En contraste, las concentra- ciones de ADN promedio reportadas por estos autores son menores a las señaladas por nosotros (5-10 ng/uL vs 37,34 ng/ uL), pero los autores no reportan el grado de pureza.

La extracción de ADN con el presente protocolo, no evi- dencia una correlación lineal (valores de R< 0,02) entre canti- dad de tejido o tamaño en relación a la cantidad o pureza de ADN extraído desde ejemplares individuales de L. youngi. Estos resultados son comparables a los obtenidos para otros grupos de insectos como aedinos (De Armas et al. 2005), por lo que estas variables de talla corporal no afectan los resulta- dos. En general, la efectividad y ventaja en la extracción del ADN obtenido utilizando el protocolo de sales con modifica- ciones, son comparables a los señalados por Nodarse et al. (2004) y De Armas et al. (2005) para insectos vectores de mayor peso corporal como los triatóminos o aedinos.

La modificación del protocolo de Arrivillaga et al. (2003) con base en sales (efecto salting out) es una alternativa efecti- va para tener suficientes muestras de ADN de flebotomíneos con alto rendimiento para estudios genéticos poblacionales con especies de pequeña talla corporal.

Agradecimientos

Al Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, Fonacit por el financiamiento del Proyecto-S1 No. 20010000921 otorgado a Jazzmin Arrivillaga. Igualmente, se extiende el agradecimiento a la Coordinación de Lic. en Biología, Decanato de Estudios Profesionales por el financiamiento otorgado a Gabriel Golczer para el desarrollo del presente trabajo.