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Abstract

Spanish

Recent investigations have been suggested mitochondrial DNA as important tool in molecular entomology studies that include not only species identification, but also establishment of phylogenetic and evolutive relationships among insects.

In this work we amplified and sequenced a fragment of 380 pb from the mitochondrial ribosomal large subunit; this preliminary work was done in order to obtain sequences with potential use as taxonomic character in sand flies. Primers used for PCR amplification and DNA sequencing were designed based on the consensus sequence of insects previously reported for this region. A bias toward adenine and thymine (81%) is consistent with the base composition of mtDNA sequences of other insects. Multiple alignment among sequences did not show ambiguities characteristic of nuclear DNA and preliminary comparisons suggest their utility as taxonomic character at the species level.

Keywords

Sandfly PCR Mitochondrial DNA Sequences

Introducción

Los flebotomineos, (Diptera:Psychodidae) de los géneros Phlebotomus y Lutzomyia son los insectos transmisores de leishmaniosis en el viejo y nuevo mundo respectivamente (Ashford et al. 1992). Esta enfermedad, potencialmente fatal causada por el parásito protozoo del género Leishmania, ha recibido recientemente especial atención por el creciente número de casos diagnosticados y el aumento en la población de riesgo (Ashford et al. 1992; Mutebi et al. 1998).

Los estudios epidemiológicos y de control de la enfermedad requieren la identificación de la o las especies vectoras; sin embargo, este trabajo, basado generalmente en caracteres morfológicos, se dificulta por el pequeño tamaño de estos insectos y los procedimientos necesarios para la observación de estructuras internas importantes como las espermatecas de las hembras, que requieren aclaración y montaje de los especímenes. Adicionalmente, muchos de los caracteres morfológicos diagnósticos de especie se encuentran presentes en un solo sexo (Young y Duncan 1994).

La existencia de especies isomórficas y complejos de especies en flebotomineos ha sido sugerida mediante estudios isoenzimáticos y por algunas técnicas de entomología molecular como amplificación al azar de fragmentos de ADN usando PCR (Lanzaro y Warburg 1995); tales estudios han señalado la necesidad de implemetar nuevas estrategias que permitan identificar las especies que conforman los complejos y que podrían diferir en aspectos como la capacidad vectorial, lo cual traería importantes implicaciones en la transmisión de la enfermedad (Lanzaro y Warburg 1995).

Así mismo y de acuerdo con los principales estudiosos de la taxonomía de estos pequeños dípteros de la familia Psychodidae, los esque mas de clasificación y la interpretación de los mismos deben ser constantemente reexaminados y la inclusión de nuevos caracteres taxonómicos -además de los morfológicos- es necesaria para la determinación de las relaciones taxonómicas y filogenéticas, un aspecto poco estudiado y entendido hasta ahora (Young y Duncan 1994).

El ADN mitocondrial, por su herencia materna y su relativa tasa de cambio rápida, se constituye en una herramienta importante de la entomología molecular que permite su utilización en estudios taxonómicos aumentando el número de caracteres disponibles para tales estudios y solucionando dificultades de la taxonomía clásica (Beard et al. 1993). La subunidad larga ribosomal, del ADN mitocondrial ha sido ampliamente estudiada en insectos de los órdenes Diptera, Orthoptera e Hymenoptera y su utilidad ha sido probada a diferentes niveles (Flook y Rowell 1997).

En el presente estudio se amplificó y secuenció exitosamente un fragmento de 380 pb obtenido a partir de Lutzomyia longipalpis vector de leishmaniosis visceral y Lutzomyia gomezi vector de leishmaniosis cutánea en latinoamérica, usando unos oligonucleótidos diseñados con base en las secuencias publicadas de insectos cómo Anopheles quadrimaculatus, Apis mellifera y Drosophila melanogaster; dado que éste es un estudio preliminar, cuyo objetivo principal constituyó la búsqueda de oligonucleótidos adecuados para la amplificación exitosa por técnicas de PCR e identificación de secuencias de uso potencial en estudios de taxonomía y filogenética de Lutzomyia spp. no se incluyen análisis detallados de sistemática molecular.

Materiales y Métodos

Especímenes de Lutzomyia spp.

Las secuencias fueron obtenidas de 18 especímenes de Lutzomyia, de los cuales 16 correspondían a L. longipalpis y 2 a L. gomezi.

Los especímenes estudiados de L. longipalpis provenían de Colombia y de otros países que permitieron observar la variabilidad de las secuencias respecto a la distribución geográfica. La tabla 1 muestra la procedencia de los ejemplares de L. longipalpis y L. gomezi utilizados en el estudio.

Tabla 1.

Procedencia de los especímes de Lutzomyia spp. utilizados para la extracción y ampliación de ADN

Especie	País	Departamento y/o Estado	Localidad -vereda	Fuente
L. longipalpis	Colombia	Cundinamarca	El Callejón	Cristina Ferro
	Colombia	Santander	Girón-palo gordo	Victor Angulo
	Brazil	Ceará	Sobral	Robert Tesh
	Brazil	Minas Gerais		Robert Tesh
	Venezuela	Trujillo	El Batatillo	José V. Scorza
	Guatemala	El Progreso		Nidia Rizo
L. gomezi	Colombia	Antioquia	Montebello	Sandra Uribe

Aislamiento y amplificación de ADN por técnicas de PCR.

Los especímenes fueron criopreservados o mantenidos en isopropanol al 100%. Para la extracción de ADN solo se utilizaron machos cuyas terminalias fueron previamente removidas y aclaradas en medio Hoyer's para verificar la identidad de la especie usando las claves taxonómicas de Young y Duncan (1994). El ADN fué aislado de especímenes individuales por el método de Collins y Porter (1990); tres especímenes se utilizaron por cada localidad para L. longipalpis con excepción de Guatemala de donde solo un ejemplar fué disponible y dos para L. gomezi.

El fragmento de 380 pb fué amplificado usando los oligonucleótidos LRJ12966 (AAA AAA ATT ACG CTG TTA TCC CTA A) y LRN13393 (C (G/A)C CTG TTT AAC AAA AAC AT) diseñados y construídos en el Center for Diseases Control (Atlanta, Georgia) con base en la secuencia consensus de dos regiones altamente conservadas del gen de la unidad larga ribosomal mitocondrial de seis especies de invertebrados depositados en el banco de genes (Gen Bank). Las especies elegidas para diseñar los primers y los números de identificación en el banco de genes son las siguientes: Anopheles gambiae (L20934), Anopheles quadrimaculatus (LO4272), Apis mellifera (LO6178), Drosophila melanogaster (U37541) y Locustus migratoria (X80245).

Después de una fase inicial de desnaturalización del ADN a 94° C, durante tres minutos, los parámetros de amplificación para los siguientes 35 ciclos de PCR fueron: desnaturalización por un minuto a 93° C, alineamiento por un minuto a 50° C y extensión por 1 minuto a 72° C. Para verificar la amplificación, parte de la muestra fué sometida a electroforesis en un gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio.

El ADN amplificado fue purificado usando Wizard PCR preps (Promega) para productos de PCR. Los productos de PCR fueron secuenciados directamente en ambos sentidos de la doble cadena usando un secuenciador automático ABI 377 (Perkin Elmer) y analizadas con el paquete GCG (Genetics Computer Group). Las secuencias fueron editadas usando el programa Sequencing Navigator (Perkin Elmer) comparando las secuencias en ambos sentidos de la doble cadena para cada especímen y posteriormente alineadas por el programa pileUp de GCG. La variabilidad haplotípica, la composición en términos de nucleótidos y el porcentaje de transiciones-transversiones entre las secuencias fueron igualmente determinadas.

Resultados

Amplificación de ADN mediante PCR.

La Figura 1 muestra la amplificación exitosa del fragmento de 380 pb de algunos de los especímenes visualizada en un gel de agarosa al 1%; el tamaño de la banda fué determina do por comparación con el marcador de peso molecular de 1 Kb (Promega) que aparece en las líneas extremas de la fotografía del gel. La identidad del fragmento fué corroborada posteriormente al comparar las secuencias con la secuencia referencia de Auoplieles gambiae (Beard et al. 1993 l.

Figura 1.

Verficación de la amplificación de mt lrRNA en gel de agarosa 1%. Los carriles de los extremos corresponden al marcador de peso molecular 1Kb (promega) Los otros carriles corresponden a productos amplificados por PCR y/o purificación (línea infe rior) en L. longipalpis de diferentes localidades y L. gomezi. C1: L. longipalpis El Callejón (Cundinamarca), C2: El Callejón especímen 2, C3: El Callejón especímen 3, C4: Girón (Santander), C5: Girón (Santander) especímen 2, C6:Girón (Santander) especímen 3, C7: Minas gerais (Brazil), C8: Minas gerais (Brazil), especímen 2, C9: Minas gerais (Brazil), especímen 3, C10: Sobral ceará (Brazil) C11: Sobral ceará (Brazil), especímen 2, C12: Sobral ceará (Brazil), especímen 3, C13: Tulumajillo (El Progreso, Guatemala) C14: Trujillo (Venezuela), C15: Trujillo (Venezuela), especímen 2, C16: Trujillo (Venezuela), especímen 3, C18: L. gomezi (Montebello), C20: L. gomezi (Montebello) especímen 2. Los carriles C21-C230 corresponden a los productos de PCR purificados de los productos de PCR visualizados en los carriles C1-C10.

Secuencias.

Las secuencias obtenidas para LU1ZOl11yia corresponden a las posiciones 12904 - 13284 de la secuencia referencia de Anopheles gambiae y la homología entre ellas fué de 80 % para L. gomezi y 79.8 % para L. langipalpis.

La composición de las bases fué similar en todas las secuencias de Lutromvia. las cuales aparecen en la Figura 2. las proporciones de las bases variaron entre 36.8-41 % para timina, 38.6-41.5 para adenina, 5.5-8.8 para guanina y 9.4-10.8 para citosina.

Los porcentajes promedio de cada una de las bases fueron:

A: 42%. T: 39o/c. O: 8%, y C: II %. Altas proporciones de adenina-tirnina (81 %) en total son consistentes con la composición de estos nucleótidos encontrada en secuencias de ADN mitocondrial en otros insectos (Simond et al.1994).

En el alineamiento múltiple de pileUp bajo OCO (Fig. 3) se observaron 14 haplotipos entre las 18 secuencias. Un haplotipo es definido en la vía usual. es decir, como una secuencia única de ADN rnitocondrial que puede dis mguirse de cualquier otra secuencia homóloga por lo menos por una substitución nucleotídica. Los haplotipos comunes en dos o más individuos fueron encontrados solo en Lutzomvia de la misma especie (L. gonicti¡ y de la misma localidad, (L. longipalpis de Trujillo. Venezuela) y ningún haplotipo fue compartido por las dos especies. El alineamiento múltiple de las secuencias resultó en 380 caracteres incluyendo tres deleciones en las posiciones '+3.123 y 353 en las secuencias de L. longi-palpis en relación con las de L. gomezi; igualmente. una deleción adicional fue observada en la posición 163 del alineamiento para las secuencias de L. longipalpis, Brazil Minas Gerais, El Progreso. y Guatemala en relación con las otras secuencias de L. tongipolpís. De los 380 caracteres, 58 (15%) fueron variables entre las secuencias: el porcentaje de las Transversiones -cambios de purina por piri midina y visceversa- fué mayor que las transiciones -carnbios de purina por puri na y/o pi ri m idi ua por piri midi na- (7 O 'le y 30% respectivamente) y la mayoría de las transverionex fueron A- T (55%). algo comúnmente observado en secuencias de ADN ribosomal mitocondrial en insectos (t igro y Grapputo 1993).

Al comparar las secuencias entre L. gomezi y L. longipalpis; se encontraron 58 sitios polimórficos incluyendo las deleciones previamente descritas, mientras que entre L. longipalpis ee los diferentes países sólo se observaron 16 sitios polirnórficos, Entre L. longipalpis de una misma localidad se presentaron variaciones puntuales entre especímenes como los de Girón (Santander), donde se observaron cambios de O por T, C por T, A por T y G por A en las posiciones 16, 143, 256 Y 367, respectivamente.

Variaciones puntuales como éstas son frecuentemente observadas entre insectos de la misma especie. en particular cuando los especímenes estudiados provienen del campo (Besanski et al. 1997).

Algunas diferencias encontradas entre L. longipulpis de diferentes localidades en un mismo país permitieron separar las Lutzomyia provenientes de estas localidades por inspección visual del alineamiento, como en el caso de Minas Gerais. Sobral Ceará en Brazil y otras: sin embargo, estas variaciones fueron pocas: uno a tres sitios polimórficos.

El hecho de que el alineamiento de las secuencias obtenidas directamente deproductos de PCR no revelara arnbiguedades características de heteroplasmia dentro o entre las dos especies. sugiere que los segmentos secuenciados corresponden a ADN mitocondrial y no a copias nucleares (Besan ski el 01. 1997).

La comparación con secuencias homólogas previamente estudiadas en otros insectos y en especial con Anopheles gatnbiae confirma la identidad de las secuencias y la utilidad de los oligonucleótidos usados en este estudio para amplificar mtR A en Lutt omvio spp.

Discusión

En este estudio se presentan las secuencias de un fragmento de 380 pb de la unidad larga ribosornal mitocondrial en L. IOllgipalpis y L. gomeii vectores de leishmaniosis. Regiones homólogas han sido amplificadas y secuenciadas en otros dípteros, pero no en fleboto mineos (Lanzaro y Warburg 1995: Esseghir et al. 1997). Las únicas secuencias de ADN mitocondrial publicadas hasta la fecha en la familia Psychodidae corresponden a fragmentos de los genes Cirocrorno B y NADH I obtenidos a partir de insectos pertenecientes al género Phlebotomus -transmisor de leishmaniosis en el viejo mundo- de las especies papntasi. bergeroti, dubosqui y otras del Mediterraneo (Esseghir et al. 1997).

Numerosos estudios han mostrado que el ADN mitocondrial de insectos posee una proporción alta en adenina y timina y las Lutzomvia incluídas en este estudio no fueron la excepción con un promedio de de 81 % entre las 18 secuencias: sin embargo. este valor aparece alto. cuando se compara con las secuencias de regiones homólogas de insectos estudiados hasta la fecha (ver tabla 2 en Simond et al. 1994).

Por ejemplo, la región homóloga en 32 especies de cucarachas mostró' un promedio de 72% en A- T (Kambhapati 1995) y para miembros de la familia Cicadelidae. Fang et al. (1993) encontraron un promedio de n % de A- T valores más bajos que el encontrado en el presente estudio.

En el caso de Anopheles gaiubiae el contenido de A-T observado fue de 80% en casi la totalidad del gen con aproximadamente 1150 pares de bases (Beard 1'1al. 1993).

Igualmente, estudios similares en fragmentos más largos de la unidad larga ribosomal mitocondrial en insectos de la familia, Aphidiidae (Hymenoptera), y Lachnidae (l lornoptera). revelaron un contenido de A-T de aproximadamente 75% (Kambhampti datos no publicados).

En cuanto a las sustituciones nucleotídicas. el promedio de la tasa de transiciciones de 30%(entre Luttotnvia, observado en este estudio. es considerablemente mayor que el encontrado en otros insectos como terrnitas y cucarachas de 8 y 7 % respectivamente (Karnbhapati 1995): mientras que en cucarachas las tasa de transición C-T fué dos veces más frecuente que la de A-G, en Lutromvia al igual que en termitas la proporcion en los cuatro tipos de transiciones fué relativamente igual (Karnbhapati et al. 1996)

La tasa de transversiones de 70% fue más alta que la encontrada en otro, insectos. sin embargo. el porcentaje en las transversionesA-T fue menor respecto al de cucarachas) similar al de termitas (Kambhapati 1995: Kambhapati (et al. 1996).

La variabilidad en las sustituciones nucleotídicas confirma la existencia de diferencias en la dinámica evolutiva del gen 16S rRNA entre grupos de insectos propuesta por Kambhampati et al. (1996).

La variación en el contenido de A-T en secuencias de AD mitocondrial en insectos ha sido previamente demostrada y ha sido particularmente estudiada en Hymenoptera. donde la cantidad de A-T alcanza extremas proporciones (Crozier y Cro z ier 1989: Dietrich el (/1. 1997)

Investigaciones previas sugieren que las fluctuaciones en la composición de nucleótidos son consecuencia directa del tipo de evolución de DNA mitncondrial en insectos y que los efectos potencialmente adversos de esta variación en la taxonomía y reconstrucción filogenética deben ser considerados. por lo tanto. estudios haxado» en secuencias como las de Hyrnenoptera y Lutzomyia descritas en este trabajo con altos contenidos de A-T deben contemplar este aspecto en el análisis estadístico IFlook y Rowell 1997).

Figura 2.

Secuencias del fragmento de la unidad larga ribosomal obtenidas a partir de especímenes de L. longipalpis y L. gomezi nótese la composición nucleotídica con altas proporciones de A. T.

Figura 3.

Alineamiento múltiple de las secuencias de mt IrRNA bajo PileUp programa GCG (Genetic Computer Group) para L. longipalpis y L. gomezi. llo bm: L. longipalpis Brazil Minas gerais; llogp: Guatemala; llotv: Venezuela, Trujillo; llocs: Colombia, Santander; llocc: Colombia, Cundinamarca; llosc: Brazil, Sobral Ceará; Igo: L. gomezi Antioquia; r1: especímen 1; r2: especímen 2; r3 especímen 3.

La gran cantidad de A-T presente en ADN mitocondrial de insectos ha sido explicada asumiendo que por razones desconocidas existe un fenómeno evolutivo que hace que las enzimas involucradas en la transcripción y replicación de ADN rico en A-T han evolucionado para hacer este proceso más efectivo que en el caso de G-C; (Wolstenholme y Clary 1985; Crozier et al. 1989). Adicionalmente, se ha propuesto la conversión de pares de GC hacia AT mediante alquilación (Watson et al. 1987), ya que, al parecer, en insectos existen cantidades grandes de agentes alquilantes endógenos producidos en la mitocondria la cual es además ineficiente en importar la maquinaria de reparación para combatir las mutaciones resultantes de metilación (Beard et al. 1993).

El número de diferencias en términos de nucleótidos a nivel de especie entre L. gomezi y L. longipalpis encontradas en las secuencias de la unidad larga ribosomal es considerablemente mayor que el encontrado entre L. longipalpis de los diferentes paises (58 y 16 respectivamente), lo cual sugiere la utilidad potencial de este fragmento para diferenciar especies en Lutzomyia; sin embargo, por el número pequeño de especies e individuos incluídos en este trabajo este aspecto deberá ser verificado cuidadosamente en estudios posteriores, ya que este gen ha sido utilizado para estudiar relaciones filogenéticas en insectos a diferentes niveles de divergencia desde subespecies y poblaciones (De Salle et al. 1992; Fang et al. 1993; Nigro y Grapputo 1993; Vogler y De Salle 1993; Xion y Kocher 1991) hasta niveles más profundos como especies, familias y órdenes (Derr et al. 1992; Carmean et al. 1992; Funk et al. 1995; Kambhapati 1995; Flook y Rowell 1997).

Finalmente, es importante considerar que a pesar del desarrollo reciente de la metodología molecular para el estudio de insectos, la identificación y el aislamiento de secuencias útiles a determinados niveles de divergencia, continúa siendo problemático (Doolittle et al. 1996); en el análisis de secuencias de ADN nucleares por ejemplo, aspectos como la determinación de la homología de las secuencias y los alineamientos múltiples son complicados y ya que las secuencias de ADN mitocondrial presentan menos problemas en este sentido se consideran en la actualidad como exelentes candidatos. Con base en la homología, el fácil alineamiento e interpretación de las secuencias y los polimorfismos encontrados, en el presente estudio se propone el frag mento secuenciado de la unidad larga ribosomal como de uso potencial en estudios taxonómicos y moleculares de Lutzomyia spp.; no obstante, su utilidad a diferentes niveles debe aún ser precisada.

Conclusiones

•

Los oligonucleótidos LRJ 2966 y LRN 13393, diseñados con base en las secuencias de insectos como Apis mellifera, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae y Anopheles quadrimaculatus y Locusta migratoria y las condiciones de PCR descritas en la metodología, permiten amplificar exitosamente un fragmento de 380 pb de la unidad larga ribosomal mitocondrial gen 16SrRNA en L. gomezi y L. longipalpis.

•

Las secuencias de la unidad larga ribosomal obtenidas de Lutzomyia poseen una alta proporción de A-T (81%) y un porcentaje de transiciones-transversiones similares a los descritos para regiones homólogas en otros insectos.

•

La amplificación y obtención de las secuencias de la unidad larga ribosomal mitocondrial a partir de Lutzomyia spp permite disponer de caracteres moleculares como herramienta para resolver los problemas de complejos de especies y especies morfológicamente indistinguibles.

•

El polimorfismo de las secuencias en términos de nucleótidos a nivel intra e inter específico, observado en los alineamientos múltiples, sugiere la utilidad de este fragmento como criterio taxonómico a nivel de especie para especies del género Lutzomyia; sin embargo, el nivel de utilidad de estas secuencias deberá ser examinado en estudios posteriores que incluyan mayor número de especies y especímenes.

•

La estandarización de técnicas de PCR y la obtención de secuencias de ADN a partir de insectos de importancia agrícola o médica como Lutzomyia spp en este caso, constituyen un avance en el desarrollo de áreas tan importantes como la sistemática molecular de insectos en Colombia

Footnotes

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a COLCIENCIAS y la Universidad de Antioquia CODI por la beca y coofinanciación que permitieron el desplazamiento de Sandra Uribe al Center for Diseases Control en Atlanta Georgia y la realización exitosa de este trabajo.

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