Abstract
The fungicides triadimefon and hexaconazol caused in vitro total inhibition of germination and growth of the fungus Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., a pathogen of the coffee berry borer Hypothenemus hampei (Ferrari); cypro-conazol and copper oxychloride were less toxic. Among the insecticides, phenytrothion was the most detrimental, followed by pirimiphos-metil and endosulphan, dicrotophos was slightly less inhibitory. This is the first time that a fungal chlamydospore formation in B. bassiana is recorder.
Introducción
El hongo Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. (Hyphomycetos) es un entomopatógeno que ataca la broca del café, Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Scolytidae); este hongo ha sido encontrado en Java, Sri Lanka, Uganda, Camerún, Jamaica, México, Brasil y Ecuador (Moore y Prior 1988) y recientemente en Colombia, donde hasta el momento se ha aislado de 30 especies de insectos (Bustillo 1991). Sus huéspedes son principalmente miembros de los órdenes Lepidoptera y Coleoptera, incluyendo insectos de importancia económica en la agricultura (Bustillo 1991; Storey y Gardner 1986).
El uso de B. bassiana para controlar insectos, como la broca del café, depende de la sobrevivencia de la conidia infectiva en el ambiente, la cual a su vez puede ser afectada por la interacción con agroquímicos. La actividad de varios insecticidas, nematicidas, fungicidas y herbicidas contra B. bassiana está bien documentada (Anderson y Roberts 1983; Gardner y Storey 1985; Lazo 1990; Loria et al. 1983; Olmert y Kenneth 1974; Ramarajahe Urs et al. 1967; Storey y Gardner 1986; Tedders 1981). La actividad potencial fungicida de estos agroquímicos podría alterar la epizootia natural de la enfermedad o disminuir la eficacia, en el campo, de las formulaciones aplicadas. Sin embargo, en Colombia aún no se han emprendido investigaciones que señalen el comportamiento del hongo B. bassiana frente a los plaguicidas, a excepción de los trabajos desarrollados en el Laboratorio de Patología de Insectos de CENICAFE (Vélez 1990).
Dentro del marco del Manejo Integrado de Plagas (MIP), la práctica del control microbiológico debe hacerse en forma coordinada con los componentes del MIP para que no interfieran en su ejecución, como podría ocurrir con el uso de fungicidas e insecticidas que limitan la población de enemigos naturales en los cultivos y reducen su impacto sobre las poblaciones de insectos plagas. Además, con el uso de entomopatógenos es posible disminuir en forma racional el impacto.
La mayoría de estudios de compatibilidad entre plaguicidas - B. bassiana han usado medios de cultivo líquidos o sólidos que contienen el producto a probar. Así, Clark et al. (1982), en medio líquido, hallaron que el fungicida mancozeb inhibe completamente al hongo, mientras que metiran y chlo-rtalonil inhiben el crecimiento, y el fungicida experimental CGA 48988 no lo afecta. También encontraron que los insecticidas azinphosmethyl, carbofuran y permethrin no afectaban al hongo en ninguna de las dosis probadas bajo las condiciones de laboratorio y de campo.
Loria et al. (1983), al evaluar en medio sólido el efecto de los fungicidas mancozeb, metiran, metalaxyl y chlorothalonil sobre B. bassiana, encontraron que mancozeb y metiran inhibieron sustancialmente al hongo bajo condiciones de laboratorio y de campo.
Tedders (1981) halló que B. bassiana es inhibido por los fungicidas trifenil hidróxido de zinc, benomyl y zineb; el dodine fue tóxico, en contraste con sulfuro y dinocap que afectaron en menor proporción el crecimiento del hongo en medio sólido.
Olmert y Kenneth (1974), haciendo pruebas con siete fungicidas, encontraron que benomyl y maneb tienen un fuerte efecto sobre B. bassiana; daconil tiene algún efecto, mientras que oxicloruro de cobre, dinocap, binapacryl y zineb no tienen efecto sobre el hongo bajo condiciones de laboratorio.
Lazo (1990), al probar la tolerancia de diez cepas de B. bassiana aisladas de adultos de brocas en diferentes zonas productoras de café en Honduras, encontró que todas sufrieron una reducción en la tasa de crecimiento micelial y en la esporulación en un medio que contenía 1.500 ppm de oxicloruro de cobre; sin embargo, las cepas poseían diferentes grados de tolerancia.
Ramarajahe Urs et al. (1967), al evaluar el efecto de seis insecticidas sobre B. bassiana en medio líquido, hallaron que dimecron fue el más inocuo, favoreciendo el crecimiento en todas las concentraciones probadas, mientras que el BHC fue el más tóxico. El efecto inhibitorio de endrin, malathion, folidol y DDT sobre el crecimiento del hongo disminuye en el orden citado.
Anderson y Roberts (1983), al evaluar seis aislamientos de B. bassiana con 13 insecticidas, hallaron que había poca diferencia entre el efecto de los insecticidas sobre los aislamientos. Los concentrados emulsionables (endosulfan, fenvalerato, permethrin, piperonil butoxido y oxamyl) con solventes aromáticos fueron más inhibitorios para el hongo; los piretroides (permethrin y fenvalerato) como materiales técnicos y formulados también fueron inhibitorios en menor proporción.
Anderson et al. (1989), al evaluar el efecto de cinco insecticidas, encontraron que abamectin, triflumuron, thuringiensin y carbaryl son compatibles con B. bassiana, mientras que fenvalerato mostró inhibición significativa bajo condiciones de laboratorio y de campo. Gardner y Storey (1985) hallaron que los herbicidas acifluorfen, alaclor, diclofob, dinoseb, fluazifob, metalaclor, oxifluorfen y paraquat inhiben el crecimiento micelial de B. bassiana. Igualmente encontraron que el glifosato y el horyzalin inhiben altamente el hongo en las dosis evaluadas.
Storey y Gardner (1986) intentaron determinar la germinación conidial en respuesta a varios adyuvantes de aspersión, comúnmente usados en mezclas de tanque con plaguicidas o como agentes humectantes en preparados de suspensiones de conidias para la diseminación artificial de hongos, además de estudiar el efecto de cuatro reguladores de crecimiento de plantas (RCP) sobre el hongo. Los resultados mostraron que los RCP flurprimidol, paclobutrazol y silaid inhiben la germinación y el crecimiento micelial en todas las concentraciones probadas, mientras mefluidide no lo hace in vitro. En cuanto a los adyuvantes, hallaron que de todos los probados: Miller-aide, Neu-film 17, Ortho X-77, Plyac, Pro-stik, Triton Ag-98, Triton CS-7 y Tween 80, sólo el Triton CS-7 inhibió la germinación conidial en laboratorio.
Alves (1986) referencia el efecto de varios fungicidas sobre B. bassiana, concluyendo que benomyl, captan, thiabendazole, maneb, granosan-L y panogen inhiben al hongo; en cambio, binapacryl, zineb, oxicloruro de cobre, daconil, pentacloronitrobenceno, dinocap y kasumin no lo hacen in vitro. Al estudiar la compatibilidad de B. bassiana con varios insecticidas, halló que los más compatibles fueron Dimetoato, Phosdrin, Folimat y Ambush, siendo los más perjudiciales Diazinon, Lannate y Super Rhodiatox; igualmente encontró que los herbicidas bentazon, simazin, alachlor y oxadiazon son compatibles con el hongo, mientras que el 2,4,D amina y el dicamba 2,4,5,T son incompatibles en todas las dosis probadas.
Se ha observado que la adaptación de diferentes hongos a medios nutritivos que contienen cobre es estable y que esta estabilidad difiere según la especie (Parry y Wood 1958; Partridge y Rich 1962). Yamasaki y Tsuchiya, citados por Ashida (1968), encontraron que cepas de Piricularia orizae Cav. mantienen su resistencia al cobre después de pasar a través de la planta huésped. Incluso, se ha demostrado la inducción de clamidosporas en Fusarium sp. por soluciones salinas estériles y por sustancias del suelo (Ford et al. 1970; Hsu y lockwood 1973).
Los registros citados se refieren a la adaptación de los hongos en laboratorio. En contraste, en el campo hay poca evidencia de la aparición de cepas de patógenos resistentes a fungicidas a base de cobre (Parry y Wood 1958). Taylor (1953) halló, en pruebas de germinación, que las esporas de Physalospora obtusa (Schw.) Cke. procedentes de huertos tratados regularmente con una mezcla de Bordeaux fueron más resistentes al cobre que las esporas de huertos sin tratar.
El crecimiento radial de la colonia se ha empleado como criterio de inhibición (Olmert y Kenneth 1974); la germinación conidial también puede ser un criterio de compatibilidad (Clark et al. 1982; Gardnery Storey 1985; Storey y Gardner 1986). La importancia de medir estas variables es observar si existe algún efecto deletéreo sobre el hongo, como podría ser la inhibición del crecimiento celular o la germinación conidial, la muerte de todo o cierto porcentaje del micelio o de conidias, la inhibición de ciertas actividades metabólicas normales como la respiración y la inhibición de algún hábito normal como la esporulación (Ashida 1965); esto no indica que los efectos de los plaguicidas pueden influir sobre los parámetros de la iniciación de una epizootia, como es la supervivencia del inóculo (Loria et al. 1983), sin olvidarse de que hay un período crítico para la germinación y el crecimiento de las conidias de B. bassiana después de la aspersión, cuando el efecto de los plaguicidas está minimizado (Anderson y Roberts 1983; Batista et al. 1983).
El objetivo de este estudio fue evaluar, in vitro, la compatibilidad del hongo B. bassiana con fungicidas usados en la zona cafetera colombiana para el control de la roya del café (Hemileia vastatrix Berk. y Br.) y con insecticidas de posible uso en programas de manejo integrado de la broca del café.
Materiales Y Métodos
En este estudio se utilizaron conidias del hongo B. bassiana cepa Cenicafé Bb-9002, aislado de adultos de H. hampei, proveniente de las formulaciones producidas en el laboratorio de Patología de Insectos de CENICAFE. Para el ensayo, en cajas de petri, se preparó el medio de cultivo para hongos Agar-Dabouraud-Dextrosa (SDA) acidificado con ácido láctico al 0,44% para evitar el crecimiento bacteriano.
Se evaluó la compatibilidad de B. bassiana con los fungicidas cyproconazol, hexaconazol, triadimefon y oxicloruro de cobre, y con los insecticidas pirimifos-metil, dicrotofos, fenitrothion y endosulfan. Se evaluaron la dosis comercial (DC), la mitad de la dosis comercial y 1/10 de la dosis comercial de estos plaguicidas (Tabla 1); el criterio para usar las dosis propuestas está basado en la idea de estimar hasta que punto existe compatibilidad de los productos con el hongo B. bassiana (Ignoffo et al. 1975).
Para evaluar la compatibilidad de los tratamientos con el hongo en el laboratorio, se midieron las siguientes variables:
El efecto de los tratamientos (Tabla 1), evaluado en cada una de las variables citadas, se organizó bajo un modelo completamente al azar. Los datos se sometieron a un análisis de varianza y la comparación entre medidas se hizo por contrastes ortogonales con el procedimiento del modelo lineal general del Sistema de Análisis Estadístico (SAS 1988). Las variables se analizaron estadísticamente con un nivel de significancia del 0,05%. La unidad experimental fue cada una de las cajas de petri, y por tratamiento se tuvieron 10 repeticiones, según la variabilidad presentada en el crecimiento micelial en el laboratorio de Patología de Insectos de CENICAFE (Vélez 1990).
Fungicidas, insecticidas y dosis evaluados en el estudio de compatibilidad con B. bassiana
Resultados Y Discusión
A las 24 horas de evaluación, todos los fungicidas e insecticidas probados inhibieron la germinación conidial de B. bassiana en la dosis comercial (DC); en la DC media, la germinación del hongo fue inhibida severamente por el oxicloruro de cobre (85,4%) y por el dicrotofos (77,8%); el cyproconazol en 1/10 de la DC, también inhibió fuertemente la germinación conidial (82,52%); el oxicloruro de cobre y el dicrotofos en 1/10 DC tuvieron un efecto moderado sobre la germinación de la conidia, 39,41 y 30,4%, respectivamente (Tabla 2).
Porcentaje de germinación de conidias de B. bassiana, en concentración de 1 x 10º c/ml, 24 horas después de la inoculación.
En cuanto al efecto de los fungicidas en el desarrollo radial de la colonia de B. bassiana en cultivo sólido, todos mostraron completa inhibición en la DC, a los 30 días de evaluación; en la DC media, el oxicloruro de cobre ejerció una alta inhibición (97,39%) pero en 1/10 de la DC el oxicloruro de cobre no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento de B. bassiana (Tabla 3, Fig. 1). Estos resultados concuerdan con los hallados por Lazo (1990) y Olmert y Kenneth (1974), en cuanto al efecto del oxicloruro de cobre sobre el hongo. El cyproconazol, en 1/10 de la DC, inhibió el desarrollo del hongo moderadamente (19,34%) (Fig. 2).
Crecimiento del hongo B. bassiana en presencia de oxicloruro de cobre.
Crecimiento del hongo B. bassiana en presencia de cyproconazol.
Entre los insecticidas probados, el fenitrothion fue el único que inhibió el crecimiento micelial en las dosis probadas; el pirimifos-metil lo hizo en la DC y en 1/2 de la DC, mientras que en 1/10 de la DC inhibió el 65,6% (Tabla 3); el endosulfan causó una alta inhibición (9%) en el crecimiento fúngico en la DC; en 1/2 de la DC, la inhibición fue del 71,65% y en 1/10 de la DC la inhibición fue del 42,38% (Tabla 3, Fig. 4). Estos resultados concuerdan con los hallados por Alves (1986) y Olmert y Kenneth (1974), quienes encontraron que endosulfan tiene efecto sobre el crecimiento de B. bassiana. El dicrotofos fue el más inocuo entre los insecticidas, en la DC inhibió al hongo medianamente (40,35%), en la DC media presentó una leve inhibición, lo mismo que en 1/10 de la DC, 21,58 y 20,58% respectivamente (Tabla 3, Fig. 5).
Crecimiento radial promedio en mm y porcentaje de inhibición del hongo B. bassiana por fungicidas e insecticidas mezclados con SDA, 30 días después de la inoculación.
Crecimiento del hongo B. bassiana en presencia de pirimifos-metil.
Los fungicidas ejercen una mayor inhibición que los insecticidas. Según la comparación de los interceptos y las pendientes, se observa que los insecticidas inhiben el crecimiento radial del micelio en los primeros días después de la inoculación, pero luego el hongo se adapta mucho más rápido al medio con dichos plaguicidas.
No todos los plaguicidas inhiben el crecimiento y desarrollo del hongo en igual proporción. Entre las dosis de oxicloruro de cobre que permiten el crecimiento del hongo, existe una diferencia significativa que fácilmente se observa en la gráfica de desarrollo radial de la colonia (Fig. 1). Con el dicrotofos, en la dosis comercial, hay un comportamiento más tóxico que con las otras dos dosis evaluadas, no existiendo diferencia significativa entre estas últimas (Fig. 5).
Los efectos de los plaguicidas sobre la germinación y el crecimiento in vitro de B. bassiana en medios nutritivos, son un indicador de posibles efectos en el campo, donde la supervivencia de la conidia, la germinación y la penetración son también factores importantes, además de que los efectos se minimizan al ser asperjado el material sobre una gran área (Andreson et al. 1989) y el tiempo de contacto es mínimo. Por otro lado, Ferron (1977) demostró, bajo condiciones controladas, que es posible que B. bassiana infecte insectos en humedades relativas bajas; lo mismo podría ocurrir con la broca en el hábitat cafetero, bajo las mismas condiciones, cuando la humedad óptima para la solubilización y absorción de los plaguicidas es menor.
En las evaluaciones de la morfología de la colonia B. bassiana en medios nutritivos que contenían oxicloruro de cobre se observó la formación de clamidosporas inducidas por este fungicida (Fig. 6). Lo mismo ocurre con otros hongos, como ha sido demostrado por Ford et al. (1970) y Hsu y Lockwood (1973), quienes registraron la inducción de clamidosporas en Fusarium por diferentes compuestos. Se sugiere la realización de posteriores estudios in vitro y en el campo para analizar la conservación de características tales como patogenicidad, habilidad de esporulación y tasa de crecimiento en cepas de B. bassiana tolerantes al cobre. También se observó la inducción de sinemas y la rápida esporulación de B. bassiana (Fig. 7) en medios que contenían cyproconazol, aunque este compuesto impidió el crecimiento radial expansivo de la colonia.
Crecimiento del hongo B. bassiana en presencia de endosulfan.
Crecimiento del hongo B. bassiana en presencia de dicrotofos.
Clamidosporas de B. bassiana inducidas por oxicloruro de cobre mezclado con SDA.
Sinemas de B. bassiana inducidas por cyproconazol mezclado con SDA
Conclusiones
Para las aplicaciones del hongo B. bassiana y agroquímicos se debe tener en cuenta su compatibilidad y modificar si es necesario el momento y los métodos de aplicación. Las aplicaciones de mezclas de B. bassiana con los plaguicidas aquí estudiados no son recomendables, pues los resultados in vitro muestran que la germinación del hongo es afectada por estos. Es necesario adelantar investigaciones del efecto de estos plaguicidas sobre la supervivencia de B. bassiana en el campo y ampliar los estudios a otros agroquímicos.
Footnotes
Agradecimientos
Este experimento fue financiado por el Centro Nacional de Investigaciones de Café CENICAFE "Pedro Uribe Mejía" y conducido en sus instalaciones. El autor agradece a los Ingenieros Agrónomos Alex E. Bustillo P. y Francisco Posada F. por su invaluable ayuda en la lectura y comentarios a este manuscrito, y a Bernardo Chaves C. por la asistencia en el análisis estadístico.