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Abstract

Spanish

In order to obtain native isolates of Beauveria bassiana with potential to control Hypothenemus hampei, 12 strains were isolated and characterized according to physiological and pathogenicity variables. Mycelia growth (MG), germination rate and conidial production (CP) in Sabouraud dextrose agar media + 0.1% of yeast extract (SDA+YE), were assessed at 25, 30 and 35 °C. In addition, the conidial production on rice was evaluated at 25 °C. There were differences (P<0.001) in the MG of the isolates. The favorable temperature for MG ranged between 25 and 30 °C. The time required to 50% of conidial germination (TG₅₀) ranged from 12.6 to 15.9 h, and the TG₉₀ ranged from 16.9 to 61.5 h. The best TG₅₀ and TG₉₀ were obtained at 25 and 30 °C. The optimum temperature for germination, of the majority of the isolates, was 30 °C. There were differences (P < 0.001) on the PdC in the SDA+YE media, and the optimum temperature for the production of conidia was 25 °C. Thus, there were differences (P < 0.001) in the production of conidia in rice. The pathogenic effectiveness of the isolates of B. bassiana on H. hampei was 100%, to the 144 h. Letal time to kill 50% of the population (TL₅₀) ranged from 71.8 to 104 h; as well as, the TL₉₀ ranged from 91.8 to 132.8 h. Native strains BbTcf9, BbTcf5 and BbTcfl were selected for its evaluation under field conditions.

Keywords

Biocontrol Coffee berry borer Entomopathogenic fungi

Introducción

La producción de café (Coffea arabica L.) bajo sombra forma parte de los recursos agrícolas en Tabasco, México (Flores 2015). Este cultivo permite la generación de divisas, empleos, y es el modo de subsistencia de pequeños productores. Además, este agroecosistema provee servicios ambientales importantes y contribuye a conservar la biodiversidad (Escamilla et al. 2005; Perfecto y Armbrecht 2003). De acuerdo con AMECAFE (2008), la entidad cuenta con 1.006 ha, e involucra a 1.226 productores (Flores 2015). Actualmente este cultivo está tomando importancia como cultivo sustentable.

La producción de café en Tabasco es afectada por diversas plagas en las que destaca Hypothenemus hampei (Ferrari, 1867) (Coleoptera: Scolytinae), conocida también como la broca del café. Para cumplir su ciclo de vida, este escolítido perfora el fruto y se alimenta de él (Dufour 2002; Vega et al. 2002; Rojas 2004). De esta manera, H. hampei causa pérdidas de peso, depreciación del grano y baja calidad de la bebida por presencia de impurezas en los granos brocados (Waterhouse y Norris 1989; Damon 2000). El primer registro de H. hampei en plantaciones de café del estado de Tabasco data de 2004 (Ramírez Del Ángel et al. 2007), y actualmente es la principal plaga insectil en la producción de café en Tabasco, México.

Una de las alternativas de control sustentable de la broca del café es el control biológico mediante la utilización de hongos entomopatógenos (Barrera et al. 1990a, 1990b; Infante et al. 1994; Monzón 2001), entre los que sobresale Beauveria bassiana (Balsamo 1835) (Gupta et al. 2003; Bhattacharryya et al. 2008; Suárez 2009). Este hongo tiene una distribución amplia y diversos aislamientos han mostrado efectividad de control de H. hampei bajo condiciones de campo (Bustillo et al. 1999). Además, produce bajo impacto sobre el ambiente y la fauna benéfica (Burges y Hussey 1971). Las características patogénicas de B. bassiana contra H. hampei, su factibilidad de reproducción de manera artificial, así como la rentabilidad de su uso, hacen de él una alternativa viable en Tabasco; sin embargo, existe la tendencia a utilizar formulados con cepas exóticas de B. bassiana, las cuales pueden tener un comportamiento diferente al de su lugar de origen.

En la búsqueda de agentes de control biológico, una de las estrategias básicas es la exploración inicial de los enemigos naturales nativos, antes de introducir agentes exóticos (De Bach 1968). En este caso, las condiciones del agroecosistema café en Tabasco sugiere la existencia de aislamientos de B. bassiana con potencial de control biológico sobre H. hampei; sin embargo, aislamientos nativos de B. bassiana no han sido obtenidos ni evaluados en este agroecosistema. La variabilidad intraespecífica en los hongos entomopatógenos en cuanto a rango de hospederos, características fisiológicas y virulencia (Drumond y Heale 1988; Ayala et al. 2005) hace necesario la caracterización para seleccionar aislamientos con las mejores características como agentes de control (Díaz et al. 2009; Torres-de la Cruz, et al. 2013). Por lo anterior, en el presente estudio se aislaron y caracterizaron 12 aislamientos nativos del hongo B. bassiana, con la finalidad de seleccionar las cepas con las mejores características fisiológicas y patogénicas para el control biológico de H. hampei.

Materiales y métodos

Obtención de aislamientos

Debido a que las plantaciones de café están distribuidas en los municipios de Teapa, Tacotalpa y Huimanguillo, seis sitios de muestreo se establecieron en cada municipio. En cada parcela se recolectaron 100 cerezas brocadas. Las cerezas se disectaron para buscar adultos muertos con signos de infección fúngica, adultos muertos sin infección fúngica, y adultos vivos. Los insectos extraídos de las cerezas se desinfestaron superficialmente en una solución de hipoclorito de sodio al 0,5% durante 5 min, y enjuagados con agua destilada estéril. Posteriormente, los insectos se colocaron individualmente en cámara húmeda (90% HR y 25 °C) durante 8 d para permitir la expresión de hongos sobre los cadáveres.

Aislamientos utilizados

Se utilizaron los aislamientos poliespóricos BbTcf1, BbTcf2, BbTcf3, BbTcf4, BbTcf5, BbTcf6, BbTcf7, BbTcf8, BbTcf9, BbTcf10, BbTcf11y BbTcf12, oriundos del estado de Tabasco, México, obtenidos de la cutícula de H. hampei. Todos los aislamientos se multiplicaron en medio de cultivo agar-dextrosa de Sabouraud + 0,1% de extracto de levadura (ADS+EL) (Feng et al. 1990).

Caracterización morfológica y fisiológica

Los hongos que se desarrollaron sobre la superficie de H. hampei, y que mostraron características compatibles con el género Beauveria, se aislaron e identificaron a nivel de especie con base a las estructuras reproductivas, según Humber (1997) y Samson (1981). Los aislamientos se depositaron en la colección de hongos entomopatógenos de la División Académica de Ciencias Biológicas, Universidad Juárez Autónoma de Tabasco, Villahermosa, Tabasco, México.

En la caracterización fisiológica se tuvieron en cuenta los siguientes parámetros:

Crecimiento micelial. A partir de cultivos in vitro de B. bassiana de 8 d de edad, un fragmento de 5 x 5 mm del borde de las colonias fue transferido al centro de una caja Petri de 90 mm de diámetro, con el medio SDA + E.L (López y Carbonell 1999). Las placas se incubaron en oscuridad a 25, 30, y 35 ± 1 °C. El crecimiento micelial (CM) se evaluó de acuerdo con Dimbi et al. (2004), registrándolo cada 2 d hasta el día que un aislamiento cubrió en su totalidad la caja, y las medidas del último día se consideraron para el análisis estadístico. Cinco repeticiones por aislamiento y temperatura se utilizaron. El efecto de la temperatura sobre el CM se evaluó mediante el porcentaje de inhibición e incremento del crecimiento radial al pasar de 25 a 30 °C, el cual se obtuvo con la fórmula: % inhibición/incremento = (crecimiento a 30 °C x 100/ crecimiento a 25 °C)-100 (Torres-de la Cruz et al. 2013).

Producción de conidios en medio SDA. A partir de colonias de 15 d de edad, un fragmento de 5 x 5 mm del borde de la colonia se colocó en cajas con medio SDA + E.L. Las cajas con el inóculo se incubaron a 25, 30 y 35 °C ± 1 °C, en oscuridad, durante 30 d. Posteriormente, los conidios se cosecharon de la superficie del cultivo, inundando la caja con agua destilada estéril + tween 80 (0.1%), y raspando la superficie con una espátula de acero inoxidable. Mediante un agitador magnético (Thermolyne®, Artur H. Thomas Co., Philadelphia, PA, EUA), la suspensión de conidios se homogenizó durante 10 min. La suspensión se filtró con gasa clínica para separar el micelio y posteriormente, con una cámara de Neubauer, se estimó el total de conidios producidos. El número de conidios ml-1 se estimó mediante la fórmula propuesta por Lipa y Slizynski (1973): C = (Cc) (4 x 10⁶) (Fd/80), donde: C = Número de conidios ml-¹; Cc = Número promedio de conidios contados en la cámara de Neubauer y, Fd = Factor de dilución. Se establecieron cinco repeticiones por aislamiento y temperatura. El efecto de la temperatura sobre la producción de conidios (PdC) en medio SDA se evaluó mediante el porcentaje de inhibición e incremento de la producción de conidios al pasar de 25 a 30 °C, y de 25 a 35 °C, los cuales se obtuvieron con las fórmulas: % Inhibición/incremento = (crecimiento a 30 °C x 100/ crecimiento a 25 °C)-100, y % Inhibición/incremento = (crecimiento a 35 °C x 100/ crecimiento a 25 °C)-100 (Torres-de la Cruz et al. 2013).

Producción de conidios en arroz. Para evaluar la capacidad de los aislamientos de B. bassiana para producir conidios en arroz, se utilizaron bolsas con 50 g de arroz, contenidos en bolsas de polipapel, se humedecieron con 12 ml de agua destilada y se esterilizaron durante 20 min a 121 °C (Porras y Leucona 2008). Posteriormente, las bolsas con arroz se inocularon con 5 ml de una suspensión de 1 x 10⁶ conidios ml-1, y se incubaron durante 15 d a 25 ± 1 °C, y fotoperiodo 12:12. Se establecieron cinco repeticiones por aislamientos. Transcurrido los 15 d, los 50 g de arroz se suspendieron en 150 ml de agua destilada estéril + tween 80 (0,1%). La suspensión fue agitada durante 10 min y posteriormente filtrada con gasa clínica para separar los conidios del arroz y micelio. El conteo de conidios se realizó en cámara de Neubauer, y la PdC g-1 se estimó mediante la fórmula de Lipa y Slizynski (1973) descrita en producción de conidios en medio SDA.

Velocidad de germinación. A partir de cultivos de 19 d de edad se obtuvo una suspensión de 5 x 10⁶ conidios ml-1, de la cual, 30 μl se sembraron en cajas Petri con medio SDA + E.L. Las cajas con los conidos se incubaron a 25, 30 y 35 °C ± 1 °C. La germinación se registró a partir de la tercera hora, hasta la hora en que un aislamiento alcanzó el 90% de germinación. Cada lectura consistió de 100 conidios. Se consideraron conidios germinados cuando el tubo germinativo alcanzó la longitud de la mitad del conidio (Jackson et al. 1985). Se establecieron cuatro réplicas por aislamiento y hora de registro.

Caracterización patogénica

Adultos de H. hampei se obtuvieron a partir de cerezas infestadas en campo. Los insectos se sumergieron en una solución de 1 x 10⁷ conidios ml-1 + tween 80 (0,1%) durante un minuto (Vélez-Arango et al. 2001). Doce aislamientos, más un tratamiento testigo se evaluaron. Los insectos del tratamiento testigo se sumergieron en agua destilada estéril + tween 80 (0,1%). Los adultos tratados se colocaron en cajas Petri, y 10 adultos de H. hampei conformaron una unidad experimental y se tuvieron cuatro repeticiones. El ensayo se mantuvo a 25 ± 1 °C y la humedad se mantuvo con agua destilada estéril en algodón. La mortalidad se registró diariamente y los "cadáveres" se colocaron en cámara húmeda con el fin de obtener esporulación. Con los datos de mortalidad diaria se estimó el tiempo letal 50 (TL₅₀) y el tiempo letal 90 (TL₉₀).

Análisis estadístico

Los datos del crecimiento micelial (CM), producción de conidios (PdC) en medio SDA, PdC en arroz, y mortalidad, se analizaron bajo un diseño experimental completamente al azar, con 12 tratamientos (cada uno de los aislamientos evaluados). Previo al análisis, los datos de CM, PdC en medio SDA y PdC en arroz, se transformaron a log (x + 1), y los datos de mortalidad se transformaron al arcoseno de la raíz cuadrada de la proporción. Los datos se sometieron a prueba de separación de medias con la prueba de (Tukey α = 0,05%) mediante SAS® (1998). El tiempo en que ocurrió el 50 y el 90% de la germinación de los conidios (TG₅₀ y TG₉₀) y el 50 y 90 % de la mortalidad (TL₅₀ y TL₉₀)se estimó mediante regresión logística y el paquete estadístico SAS® (1998).

Resultados y discusión

Identificación de aislamientos

Los aislamientos presentaron colonias con micelios de aspecto algodonoso color blanco, con superficie semielevada, y formación de sinemas. Microscópicamente, los aislamientos mostraron conidióforos sencillos, agrupados irregularmente, hinchados en la base y adelgazándose hacia el raquis donde se sostiene el conidio, coincidiendo con lo descrito para el género Beauveria por Bustillos (2001) y Rodríguez y Del Pozo (2003). Los conidios observados son lisos, redondeados a ovoides coincidiendo con lo expuesto por Samson (1981) y Humber (1997) y midieron de 3,95-7,29 x 1,38-2,83 µm, y el raquis de 4,82-9,29 x 1 µm. El tamaño de las conidios de los 12 aislamientos osciló en 2,20-2,95 x 1,96-2,39 µm, medidas que concuerdan con Humber (1997). Al respecto, Glare y Inwood (1998), al comparar diversas cepas de especies de Beauveria, provenientes de diferentes países, concluyeron que las cepas con conidios esféricos y menores de 3 µm de diámetro pueden ser consideradas como B. bassiana.

Caracterización fisiológica

Efecto de la temperatura sobre el crecimiento micelial

A 25 °C se registraron diferencias significativas (F = 28,39; df = 11; P < 0,001) en el crecimiento micelial (CM) entre aislamientos (Tabla 1). El aislamiento con mayor CM fue BbTcf5 con 3,38 ± 0,03 cm, mientras que el aislamiento con menor CM fue BbTcf12 con 2,92 ± 0,10 cm. A 30 °C el análisis registró diferencias significativas (F = 143,06; df = 11; P < 0,001) en el CM (Tabla 1). A esta temperatura el CM mostró mayor variación entre aislamientos comparado con los obtenidos a 25 °C. El aislamiento con mayor CM fue BbTcf6 con 3,49 ± 0,01 cm, y el de menor CM fue BbTcf4 2,93 ± 0,03 cm. A esta temperatura, cinco de los 12 aislamientos presentaron un incremento en el CM, y seis mostraron una reducción en relación al CM obtenido a 25 °C. La inhibición del CM fluctuó de 5% hasta 31,2 % al pasar de 25 a 30 °C.

Tabla 1.

Desarrollo micelial e inhibición o incremento de cepas poliespóricas de Beauveria bassiana.

Cepas	Desarrollo micelial (cm)			Inhibición (–) o
	25 °C	30 °C	35 °C	Incremento (+) (%)
	Media^z ± Dst	Media ± Dst	Media ± Dst	25-30 °C	25-35 °C
BbTcf1	3,34 ± 0,02 de	3,35 ± 0,03 g	0 ± 0	+0,8	-100
BbTcf2	3,09 ± 0,05 b	3,44 ± 0,03 h	0 ± 0	+43,0	-100
BbTcf3	3,35 ± 0,05 de	3,30 ± 0,00 fg	0 ± 0	-5,0	-100
BbTcf4	3,29 ± 0,04 cde	2,93 ± 0,03 a	0 ± 0	-31,2	-100
BbTcf5	3,38 ± 0,03 e	3,22 ± 0,01 de	0 ± 0	-15,7	-100
BbTcf6	3,18 ± 0,07 bc	3,49 ± 0,00 h	0 ± 0	+37,3	-100
BbTcf7	3,11 ± 0,02 b	3,22 ± 0,03 de	0 ± 0	+11,6	-100
BbTcf8	3,35 ± 0,04 de	3,27 ± 0,02 ef	0 ± 0	-8,4	-100
BbTcf9	3,24 ± 0,07 cd	3,16 ± 0,05 cd	0 ± 0	-8,0	-100
BbTcf10	3,25 ± 0,05 cde	3,08 ± 0,03 b	0 ± 0	-16,7	-100
BbTcf11	3,09 ± 0,06 b	3,23 ± 0,01 e	0 ± 0	+15,0	-100
BbTcf12	2,92 ± 0,10 a	3,11 ± 0,01 bc	0 ± 0	+21,1	-100

Medias con distinta letra en una columna son estadísticamente diferentes (Tukey P ≤ 0,05).

Cuando los aislamientos se incubaron a 35 °C, el CM fue inhibido al 100% en todos las cepas, por lo que 35 °C resultó una temperatura que impide el CM del hongo. Así, el rango de temperatura, para el crecimiento óptimo de la mayoría de las cepas nativas de B. bassiana fue de 25 a 30 °C. Estos resultados concuerdan con Studdert y Kaya (1990) quienes reportaron un rango de temperatura óptima para el crecimiento de B. bassiana de 26 a 29 °C. Así también, Hegedus y Khachatourians (1994) reportaron que a 30 °C se limita el CM de B. bassiana. Por otro lado, Ortiz-Catón et al. (2011) mencionan que la mayor velocidad de desarrollo de las cepas de hongos entomopatógenos se obtiene de 20 a 28°C. En este estudio, el mejor CM se obtuvo a 30 °C, lo cual puede ser explicado por el origen tropical de los aislamientos. Al respecto, Fargues et al. (1992) reportaron aislamientos de regiones tropicales más termotolerantes que aislamientos de clima templado. Una relación entre la tolerancia térmica y el clima de origen ha sido mostrada para otras especies de Hyphomycetes incluyendo B. brongniartii, Metarhizium flavoviride var. acridum, Paecilomyces fumosoroseus y Nomuraea rileyi (Fargues et al. 1992; Vidal et al. 1997). De acuerdo con Ekesi et al. (1999), el CM es una característica importante en la selección y producción de hongos entomopatógenos y su respuesta a la temperatura está definida por la región de origen del aislamiento y por aspectos genéticos (Vidal et al. 1997; Cortez 2010).

Velocidad de germinación

Con base al TG₅₀, se observó variabilidad en la velocidad de germinación de los aislamientos nativos de B. bassiana, el cual fue influenciado por la temperatura y el aislamiento. A 25 °C, la mayor y menor velocidad de germinación fue para los aislamientos BbTcf9 y BbTcf2 con tiempos promedios de 12,6 h y 15,9 h, respectivamente (Tabla 2). Resultados similares obtenidos por Berlanga-Padilla y Hernandez-Velazquez (2002) revelan que B. bassiana alcanza el 50% de germinación dentro de las primeras 15 h. A 30 °C, la mayor velocidad de germinación fue obtenida por la cepa BbTcf9, con un TG₅₀ de 10,7 h. La cepa BbTcf10 presentó el valor más alto de TG₅₀ con 16,3 h (Tabla 2). A esta temperatura, nueve de 12 aislamientos mejoraron su TG₅₀, respecto al obtenido a 25 °C. Los aislamientos BbTcf7 y BbTcf7 no mostraron cambios en su TG₅₀.

Tabla 2.

Tiempo de germinación del 50% de los conidios (TG₅₀) de aislamientos de Beauveria bassiana evaluados a 25, 30 y 35 °C.

Cepas	TG₅₀ (h)
Cepas	25 °C		30 °C		35 °C
	Media	RV^z	Media	RV	Media	RV
BbTcf1	15,3	(14,3-17,1)	13,8	(12,9-15,1)	18,0	(16,0-23,9)
BbTcf2	15,9	(15,1-16,9)	14,8	(13,9-16,1)	23,0	(19,0-34,5)
BbTcf3	15,5	(14,3-17,4)	15,2	(13,9-17,2)	35,4	(23,6-123,4)
BbTcf4	15,5	(14,3-17,7)	14,5	(13,7-15,7)	260	(20,2-47,6)
BbTcf5	14,1	(13,7-14,6)	12,7	(12,3-13,2)	17,1	(16,0-18,8)
BbTcf6	15,6	(14,9-16,6)	14,9	(14,0-16,0)	22,6	(18,6-35,1)
BbTcf7	15,2	(14,6-16,1)	15,2	(14,6-15,9)	15,5	(14,1-1933,5)
BbTcf8	14,8	(14,3-15,5)	14,5	(14,0-15,1)	27,9	(18,3-960,9)
BbTcf9	12,6	(12,4-12,8)	10,7	(10,3-11,1)	16,2	(15,3-17,4)
BbTcf10	15,0	(14,4-15,7)	16,3	(15,4-17,4)	16,2	(14,8-22,4)
BbTcf11	13,5	(13,0-14,3)	13,6	(13,2-14,0)	17,7	(15,6-27,1)
BbTcf12	13,5	(12,8-14,5)	12,7	(12,2-13,6)	15,7	(14,5-19,7)

RV = Rango de variación.

Respecto al TG₉₀, a 25 °C, los mejores aislamientos son BbTcf12 y BbTcf5 con tiempos promedios de 20,2 h y 20,3 h, respectivamente (Tabla 3). Estos resultados son similares a lo de García et al. (2006), quienes obtuvieron un 95% de germinación a las 20 h. A 30 °C, la mayor velocidad de germinación fue obtenida por la cepa BbTcf9, con un TG₉₀ de 14,2 h. Este tiempo de germinación superó a lo reportado por Berlanga-Padilla y Hernandez-Velazquez (2002) en aislamientos de B. bassiana con TG₉₀ de 20 h a 27 °C. La cepa BbTcf3 presentó el valor más alto de TG₉₀ con 28,9 h (Tabla 2). De acuerdo con Vélez et al. (1997), uno de los parámetros de calidad de los bioplaguicidas es que presenten una germinación del 90% dentro de las 24 h de incubación.

Tabla 3.

Tiempo de germinación del 90% de los conidios (TG₉₀) de aislamientos de Beauveria bassiana evaluados a 25, 30 y 35 °C.

Cepas	TG₉₀ (h)
Cepas	25 °C		30 °C		35 °C
	Media	RV^z	Media	RV	Media	RV
BbTcf1	23,0	(19,9-28,8)	23,0	(19,9-28,8)	23,0	(19,9-28,8)
BbTcf2	26,8	(24,2-30,6)	26,8	(24,2-30,6)	26,8	(24,2-30,6)
BbTcf3	28,8	(24,2-37,1)	28,8	(24,2-37,1)	28,8	(24,2-37,1)
BbTcf4	29,1	(24,6-37,0)	29,1	(24,6-37,0)	29,1	(24,6-37,0)
BbTcf5	20,3	(19,1-22,0)	20,3	(19,1-22,0)	20,3	(19,1-22,0)
BbTcf6	25,1	(22,9-28,4)	25,1	(22,9-28,4)	25,1	(22,9-28,4)
BbTcf7	20,7	(19,1-23,0)	20,7	(19,1-23,0)	20,7	(19,1-23,0)
BbTcf8	21,0	(19,6-23,1)	21,0	(19,6-23,1)	21,0	(19,6-23,1)
BbTcf9	16,9	(16,3-17,7)	16,9	(16,3-17,7)	16,9	(16,3-17,7)
BbTcf10	21,3	(19,7-23,5)	21,3	(19,7-23,5)	21,3	(19,7-23,5)
BbTcf11	21,7	(19,7-24,8)	21,7	(19,7-24,8)	21,7	(19,7-24,8)
BbTcf12	20,2	(18,1-23,9)	20,2	(18,1-23,9)	20,2	(18,1-23,9)

RV = Rango de variación.

A 35 °C, el aislamiento BbTcf7 registró el mejor TG₅₀ y TG₉₀ con 15.5 h y 17.0 h. El aislamiento más sensible a 35 °C fue BbTcf3 cuyo TG₅₀ se prolongó hasta las 35.4 h. Las cepas menos afectadas por esta temperatura son BbTcf7 y BbTcf9, cuyo TG₅₀ respectivo, no se vio fuertemente modificado. Aunque todos los aislamiento nativos de B. bassiana germinaron en el rango de 25 a 35 °C, la mejor temperatura para la germinación de la mayoría de los aislamientos fue 30 °C, lo cual difiere con lo reportado por Godoy et al. (2007), los cuales reportan 25 °C como la temperatura óptima. Al respecto, Alean-Carreño (2003) y Tanada y Kaya (1993) señalan que la germinación de las esporas depende de temperatura, la humedad ambiental y en menor grado a las condiciones de luz. Milner et al. (1991) mencionan que la germinación de los conidios también puede ser influenciada por el medio de cultivo en el cual se evalúa dicho parámetro.

Producción de conidios en medio SDA + E.L

El análisis estadístico mostró diferencias significativas (F = 212,79; df= 11; P < 0,001) en la PdC en medio SDA+EL, a 25 °C (Tabla 4). A esta temperatura, los aislamientos con mayor producción son BbTcf11 y BbTcf12 con 19,3x10⁷ y 19,3x10⁷ conidios, respectivamente. El aislamiento con menor PdC fue BbTcf5 con 1,9x10⁷conidios. A 30 °C, el análisis estadístico mostró diferencias significativas (F = 281,39; df = 11; P < 0,001) (Tabla 4). Al igual que a 25 °C, las cepas BbTcf12 y BbTcf11 mostraron la mayor PdC, con 4,92x10⁷ y 5x52x10⁷ conidios, respectivamente. La cepa con menor PdC fue BbTcf8 con 0,22x10⁷ conidios. Estos resultados son similares a los reportados por Godoy et al. (2007) con aislamientos de B. bassiana a 25 y 30 °C. Cuando los aislamientos se sometieron a 35° C, no hubo crecimiento ni producción de conidios. Por lo anterior, el rango de temperatura para esporulación fue de 25 a 30°C; sin embargo, la temperatura óptima fue 25 °C. Estos resultados difieren con Rosas (1995) y Barajas-Ontiveros et al. (2009) quienes reportan mayor esporulación de B. bassiana a 30 °C.

Tabla 4.

Producción de conidios de Beauveria bassiana cultivados en arroz y medio ADS + EL.

Cepa	Producción de conidios x 10⁷			Inhibición (-) o incremento (+) (%)
Cepa	Arroz	ADS + EL.^y 25 °C	ADS + EL. 30 °C	Inhibición (-) o incremento (+) (%)
	Media^x + Dst	Media ± Dst	Media ± Dst	25-30 °C	25-35^z °C
BbTcf1	311,70 ± 21,40 b	5,95 ± 0,8 cd	1,58 ± 0,2 b	-73,3	-100
BbTcf2	327,00 ± 28,39 bc	5,76 ± 0,4 cd	2,68 ± 0,7 C	-53,4	-100
BbTcf3	479,25 ± 12,67 ef	5,40 ± 0,7 C	0,22 ± 0,4 a	-95,7	-100
BbTcf4	220,57 ± 4,64 a	5,85 ± 0,4 cd	0,25 ± 0,9 a	-95,6	-100
BbTcf5	358,87 ± 23,31 C	1,19 ± 0,2 a	0,33 ± 0,3 a	-71,9	-100
BbTcf6	294,45 ± 8,40 b	6,31 ± 0,6 cd	4,04 ± 0,4 d	-35,9	-100
BbTcf7	401,17 ± 14,50 d	11,37± 0,3 e	0,54 ± 0,1 a	-95,2	-100
BbTcf8	243,97 ± 18,10 a	7,52 ± 0,7 d	0,32 ± 0,1 a	-95,6	-100
BbTcf9	485,47 ± 6,82 f	4,88 ± 0,1 C	0,47 ± 0,3 a	-90,3	-100
BbTcf10	317,70 ± 6,14 b	2,58 ± 0,6 b	0,41 ± 0,3 a	-83,7	-100
BbTcf11	243,52 ± 7,90 a	19,31±0,2 f	5,52 ± 0,1 f	-71,4	-100
BbTcf12	449,55 ± 8,80 e	24,44± 0,2 f	4,92 ± 0,1 e	-79,8	-100

Medias con distinta letra en una columna son estadísticamente diferentes (Tukey P < 0,05).

ADS + EL = agar-dextrosa de Sabouraud + 0.1% de extracto de levadura.

= A 35°C y en medio ADS + EL no hubo producción de conidios.

De acuerdo con Milner et al. (1991), la selección de las cepas con mayor productividad de conidios puede permitir que en condiciones de campo se produzca inóculo secundario que se disperse de manera natural dentro de la plantación; así también, cepas con alta productividad de conidios es una característica importante para la producción de agentes de biocontrol a escala comercial; sin embargo, la producción de conidios depende, entre otros factores, del sustrato de crecimiento (Vélez et al. 2000; Godoy et al. 2007).

Producción de conidios en arroz

El análisis estadístico mostró diferencias significativas (F = 178,83; df = 11; P < 0,001) en la PdC en arroz (Tabla 4). Las cepas que tuvieron la mayor PdC en arroz son BbTcf9, BbTcf3, BbTcf12 con 485,47X10⁷, 479,25X10⁷ y 449,55X10⁷ esporas/g de arroz, respectivamente. Los aislamientos que mostraron mayor PdC en arroz no son necesariamente los que mostraron mayor PdC en medio SDA, excepto el aislamiento BbTcf12, el cual fue uno de los que mostró mejor PdC en medio SDA a 25 y 30 °C. De acuerdo con Marín y Bustillo (2002) y Cova et al. (2009), el arroz destaca entre los sustratos más utilizados para la producción de B. bassiana a nivel comercial. La selección de aislamientos con buen potencial genético en cuanto a producción de conidios, es un aspecto básico para la producción a escala comercial de hongos entomopatógenos (Badilla 1996).

Caracterización patogénica

Todos los aislamientos mostraron patogenicidad hacia H. hampei, y alcanzaron el 100% de mortalidad a las 144 h (Tabla 5). Todos los insectos del tratamiento testigo permanecieron vivos durante los días que duró la evaluación. Al respecto, Cárdenas et al. (2007) reportaron porcentajes de mortalidad de H. hampei de 73,3 a 100%, a las 192 h de evaluación, por acción de B. bassiana. Al evaluar el TL₅₀, se encontró variabilidad entre aislamientos en cuanto al tiempo requerido para matar al 50% de la población tratada. El aislamiento que requirió el menor TL₅₀ fue BbTcf5 con 71,8 h. El aislamiento con mayor TG₅₀ fue BbTcf4 con 104 h (Tabla 5). Estos resultados difieren con Suárez y Mejía (2012), quienes reportaron aislamientos de B. bassiana con TL₅₀ sobre H. hampei de 168 h, utilizando una concentración 1 x 10⁶ conidios/ml. En cuanto al TL₉₀, la cepa BbTcf5 alcanzó el mejor TL₉₀, con un promedio de 91,8 h. El aislamiento BbTcf6 obtuvo el mayor TL₉₀ con 132,8 h (Tabla 5). Bastidas et al. (2009) obtuvieron porcentajes y tiempos similares para alcanzar el 90% de la mortalidad de H. hampei, con 106,32 y 129,6 h, respectivamente. De acuerdo con Tanada y Kaya (1993), la virulencia de cepas de hongos entomopatógenos es una característica relevante en la selección de aislamientos con fines de control biológico, debido a que se presentan diferencias importantes en la virulencia entre aislamientos de una misma especie.

Tabla 5.

Mortalidad y tiempo letal del 50 y 90 % (TL₅₀ y TL₉₀) de aislamientos de Beauveria bassiana sobre Hypothenemus hampei.

Cepa	Mortalidad (%)	TL₅₀ (h)		TL₉₀ (h)
Cepa	Mortalidad (%)	Media	RV^z	Media	RV
BbTcf1	100	88,1	(86,6-89,6)	110,3	(107,7-113,4)
BbTcf2	100	103,6	(99,3-108,3)	125,3	(118,1-138,7)
BbTcf3	100	96,4	(88,6-103,8)	115,3	(106,4-142,8)
BbTcf4	100	104,0	(102,8-105,3)	119,6	(117,4-122,3)
BbTcf5	100	71,8	(60,5-81,2)	91,8	(81,2-132,9)
BbTcf6	100	94,7	(89,3-100,6)	132,8	(121,3-154,0)
BbTcf7	100	85,4	(81,3-89,4)	102,3	(96,9-111,1)
BbTcf8	100	98,7	(89,8-107,8)	120,9	(109,9-157,7)
BbTcf9	100	92,2	(90,5-93,8)	120,1	(116,8-124,1)
BbTcf10	100	91,7	(78,9-104,2)	116,8	(103,1-176,0)
BbTcf11	100	91,3	(82,6-99,4)	113,1	(103,0-141,1)
BbTcf12	100	100,6	(98,8-102,4)	131,2	(127,2-136,2)

RV = Rango de variación.

Conclusiones

Los aislamientos de B. bassiana obtenidos de las plantaciones de café en Tabasco, México, mostraron variabilidad intraespecífica en cuanto a desarrollo micelial, producción conidial, velocidad de germinación y patogenicidad. El rango de temperatura favorable para el CM de los aislamientos fue de 25 y 30 °C. La temperatura óptima para la producción de conidios fue 25 °C. Las cepas evaluadas no fueron termotolerantes a 35 °C en cuanto al crecimiento micelial. Con base en las características evaluadas, se seleccionaron los aislamientos BbTcf9, BbTcf5, y BbTcf1 para ser evaluados sobre H. hampei bajo condiciones de campo. La variabilidad encontrada en las características evaluadas, demuestra la importancia de la caracterización de aislamientos nativos y manifiesta el potencial del hongo estudiado para el desarrollo de bioinsecticidas contra H. hampei.

Footnotes

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Este trabajo fue financiando por el Programa de Fomento a la Investigación 2012: UJAT-2012-IB-02.

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Abstract

Keywords

Introducción

Materiales y métodos

Obtención de aislamientos

Aislamientos utilizados

Caracterización morfológica y fisiológica

Caracterización patogénica

Análisis estadístico

Resultados y discusión

Identificación de aislamientos

Caracterización fisiológica

Efecto de la temperatura sobre el crecimiento micelial

Velocidad de germinación

Producción de conidios en medio SDA + E.L

Producción de conidios en arroz

Caracterización patogénica

Conclusiones

Footnotes

Agradecimientos

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