Abstract
The spittlebug, Aeneolamia varia (Hemiptera: Cercopidae) is a limiting pest of sugarcane crops in Venezuela. In Colombia, this species has been recorded for over 40 years in Llanos Orientales, attacking pastures. Only in 2007 this insect was detected in sugarcane crops in the Cauca Valley, where we are looking at biological control agents, particularly entomopathogenic nematodes. In this study, we evaluated the virulence of three entomopathogenic nematode species selected in previous laboratory and greenhouse studies, Steinernema sp.1, Heterorhabditis bacteriophora and Heterorhabditis sp. (Gua 31), and two commercially aviable species, Steinernema sp. and Heterorhabditis sp., on IV instar nymphs of A. varia. The most virulent isolates were Heterorhabditis sp. (Gua 31) causing 42.3% of mortality at a dosage of 5 x 10¹⁰ JI/ha, and Heterorhabditis bacteriophora in dosage of 1.5 x 10¹¹ JI/ha causing 76% of mortality on nymphs. This information is intended to give the farmer an effective alternative for the integrated management of A. varia.
Keywords
Introducción
Las especies del complejo de salivazos (Hemiptera: Cercopidae) se caracterizan por recubrirse de una secreción con apariencia de saliva o espuma en sus estados ninfales (Gómez 2007). Las ninfas de Aeneolamia varia (Fabricius, 1787) succionan la savia de las raíces y los adultos la savia de las hojas al tiempo que inyectan una toxina en la planta. En las hojas se produce necrosis, aparecen porciones de manchas alargadas de color pardo rojizo (Gómez 2007). En altas densidades de población el salivazo puede causar la muerte de la planta. El daño del insecto causa la reducción en sacarosa, en Ecuador se registran pérdidas en sacarosa hasta del 34% con la especie Mahanarva andigena (Mendoza 2001). Hasta el momento no se han contabilizado las pérdidas que pueda causar A. varia en cultivos de caña de azúcar en Colombia y se considera una seria amenaza para este cultivo.
A inicios del 2007, en el Valle del Cauca se encontraron insectos adultos de Aeneolamia varia en cultivos de caña de azúcar, en dos haciendas localizadas en la zona rural del municipio de Yotoco (Gómez 2007), en donde la infestación alcanzó cerca de 25.000 ha. Una descripción sobre biología, hábitos y manejo de poblaciones de A. varia en caña de azúcar, la presentan Bustillo et al. (2011).
Son pocas las investigaciones sobre el manejo de salivazos de la caña de azúcar con nematodos. Poinar y Linares (1985) en el estado de Portuguesa, Venezuela, encontraron infecciones naturales de Hexamermis dactylocercus sobre A. varia, parasitando hasta un 50% de las ninfas y adultos recolectados. Bennett (1984) encontró parasitismo de una especie de Hexamermis tanto sobre A. varia en Trinidad, como en Brasil sobre Mahanarva fimbriolata. En Brasil, Leite et al. (2002), evaluaron la eficacia de Steinernema sp., y Heterorhabditis sp., en el salivazo de la caña, Mahanarva fimbriolata (Stål) logrando mortalidades entre el 96 y el 100% bajo condiciones de laboratorio. Posteriormente Leite et al. (2005), en evaluaciones de campo encontraron que una especie de Heterorhabditis sp. (CB - n5) aplicada al suelo en un cultivo de caña, causó mortalidades del 56% en dosis de 3,3 x 10⁸ JI/ha. Cuando se comparó con aplicaciones de Metarhizium anisopliae y el insecticida thiametoxan, no encontraron diferencias estadísticas en la mortalidad del salivazo.
En el estado de Portuguesa, Venezuela, Ferreri et al. (2004) evaluaron Heterorhabditis bacteriophora Poinar, sobre ninfas de A. varia en un cultivo de caña de azúcar, aplicándolo en dosis de 5 x 10⁷ JI/ha, encontrando a las 72 horas después de la aplicación, mortalidades entre 71,4 y 75,3%. En este estudio también registraron la presencia de un nematodo nativo, Heterorhabditis indica Poinar, infectando A. varia.
El objetivo de esta investigación fue evaluar, bajo condiciones de campo, la eficacia de especies de nematodos entomopatógenos previamente seleccionadas bajo invernadero (Rosero et al. 2012) y determinar la dosis más eficaces para el control de A. varia en cultivos de caña de azúcar.
Materiales y Métodos
Producción masiva in vivo de nematodos entomopatógenos
La producción masiva, de las especies de nematodos entomopatógenos H. bacteriophora y Steinernema sp.1, se realizó en larvas de Galleria mellonella (L.) en el laboratorio de Entomología de Cenicaña ubicado en el CAB Buga (23 ± 2 °C, H.R 65% ± 8). Inicialmente, se confinaron 10 larvas de último estadio de G. mellonella, en cajas Petri de 9 cm de diámetro, con papel toalla humedecido, luego se infectaron con una suspensión de 1 ml, que contenía 1.000 juveniles infectivos (JI). Al cabo de 3 días después de la infección, se retiraron las larvas muertas con síntomas visibles de infección por nematodos (Realpe et al. 2007).
Para la emergencia y cosecha de los juveniles infectivos (JI), se pasaron las larvas parasitadas a trampas White (1927) modificadas de acuerdo con Realpe et al. (2007). Esta modificación consistió en una bandeja de plástico, con dimensiones de 28 cm de largo x 24 cm de ancho x 20 cm de alto. En su interior se colocaron 4 tubos de PVC de 1 pulgada, cortados por la mitad, para formar una canoa de 26 cm de largo. Sobre cada una de las canoas invertidas se colocó papel filtro y 80 larvas en promedio de G. mellonella infectadas por los nematodos. A cada bandeja se le adicionó agua estéril hasta llegar al borde de los tubos (Fig. 1). Los JI de cada una de las especies de nematodos, se cosecharon y contabilizaron (Realpe et al. 2007) cada 2 días, durante 16 días, la recolección se realizó en horas de la mañana y se almacenaron en frascos de vidrio (beaker de 250 ml), que se refrigeraron a 16 ± 2 °C. Al día siguiente de cada colecta se almacenaron en espumas de poliuretano (10 cm x 10 cm x 2 cm) en una concentración de 5 x 10⁶ JI/espuma y se mantuvieron a 16 ± 2 °C.
Producción masiva de nematodos en larvas de Galleria mellonella usando trampas White modificadas, con tubos de PVC en forma de medias canoas invertidas.
Determinación de la virulencia de los nematodos entomopatógenos
Para evaluar el efecto de nematodos entomopatógenos (NEPs) como controladores de A. varia en condiciones del Valle del Cauca, se establecieron experimentos en instalaciones del Servicio Nacional de Aprendizaje (SENA), Centro Agropecuario Buga (CAB), por encontrarse situado dentro del área cuarentenada por el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA 2007). Las condiciones ambientales promedias de la zona son 24 °C, una humedad relativa del 80% y precipitación anual aproximada de 1.000 mm por año.
Para obtener las plántulas, se extrajeron cerca de 500 yemas de caña de la variedad CC 84-75, sometidas a termoterapia y sembradas en germinadores, donde permanecieron alrededor de un mes a cielo abierto y riego constante con micro aspersores. Posteriormente se trasplantaron a recipientes de poliestireno con suelo arenoso 3:1 esterilizado (3 pates de arena, 1 parte de suelo) donde se busca un abundante desarrollo del sistema radicular, manteniendo las plántulas en un invernadero, con humedad en el suelo a capacidad de campo y realizando tres fertilizaciones con NPK (15-15-15) (20 gr./litro de agua) aplicándose 15 ml de solución por planta.
Transcurrido el mes, las plántulas se trasplantaron a macetas plásticas de 16 onzas (16 cm de diámetro y 14 cm de profundidad) utilizando una modificación de la metodología usada en Cenicaña para evaluar la resistencia varietal (Cuarán et al. 2012). Esta modificación consiste en retirar el suelo con la finalidad de exponer las raíces, teniendo cuidado de no causarles daño. Expuestas las raíces, se procedió a cubrirlas con suelo arcilloso esterilizado y húmedo para darle forma de cono de aproximadamente 10 cm de altura y diámetro de 15 cm en la base. Finalmente las macetas plásticas se cubrieron con hule de color blanco, el cual tiene un agujero de 5 cm de diámetro para que sobresalga la planta.
En todos los experimentos, se utilizaron las macetas plásticas con las plántulas de caña, las cuales se infestaron con huevos de A. varia (25 huevos/planta), obtenidos de la cría masiva mantenida en un invernadero en el SENA - Buga. En cada planta se permitió el desarrollo de 15 ninfas, cuando estuvieron en IV estadio, se llevaron a las parcelas experimentales, conformadas por tres surcos, separados a 0,8 m y de 5 m de largo (8 mβ), de un cultivo de caña. Las macetas se ubicaron el centro de cada parcela en jaulas de PVC, (0,5 m x 0,5 m x 0,7 m), cubiertas con toldillo (Fig. 2).
Maceta con plántula de caña infestada con el salivazo, Aeneolamia varia. A. Con la estructura de PVC. B. con la estructura cubierta con un toldillo de muselina para evitar el movimiento de insectos.
Las aspersiones (una por tratamiento) de los JI de los nematodos se hicieron sobre el suelo, en el surco central de cada parcela, retirando previamente el toldillo que cubría la jaula de PVC. Se utilizó para la aspersión una bomba de espalda de 20 L de capacidad con una boquilla de descarga TX3, empleando un volumen de agua de 1000 L/ha. Las aspersiones se realizaron en horas de la tarde (después de las 4:00 PM), con el fin de disminuir el efecto de la radiación solar sobre los JI de los nematodos, el día anterior a las aspersiones, para cada uno de los experimentos se realizo riego por gravedad hasta llevar el contenido de humedad del suelo a capacidad de campo. Los experimentos se organizaron bajo un diseño de bloques completamente aleatorios, teniendo en todos los casos cinco repeticiones y la información se analizó a través de un análisis de varianza.
La evaluación de mortalidad de las ninfas de A. varia, se inició dos días después de la aplicación, diariamente durante 18 días (Ferreri et al. 2004). En la totalidad del área correspondiente a cada tratamiento (0,25 mβ), fueron recolectadas las ninfas muertas, se llevaron al laboratorio y diseccionaron al estéreo-microscopio.
Persistencia de nematodos
Con el fin de establecer la persistencia de los nematodos asperjados en los diferentes experimentos, se planeó establecer su presencia 30 días después de la aspersión de los tratamientos. Para esto, se tomaron muestras de suelo, en cada parcela experimental. Estas muestras debidamente identificadas en cantidad de 100 g, se llevaron al laboratorio y confinaron en recipientes de plástico de 710 cm³. A estos recipientes se les introdujo 5 larvas de G. mellonella siguiendo la metodología de Bedding y Arkhurst (1975). Las larvas se retiraron 3 días después, se registró el número de larvas muertas, y se confirmó la infección por nematodos colocándolas en trampas White.
Análisis de datos
El análisis estadístico de los todos los experimentos se hizo mediante un análisis de varianza (ANOVA) y las diferencias entre tratamientos se establecieron con la ayuda de la prueba de rangos múltiples de Duncan (P = 0,05). Los porcentajes de mortalidad de ninfas de A. varia se corrigieron, en relación con el testigo, usando la ecuación de Schneider-Orelli (Ciba - Geigy 1981).
Resultados
Producción masiva in vivo de nematodos entomopatógenos
Las especies de nematodos para las evaluaciones de campo en este estudio, se produjeron satisfactoriamente usando la metodología desarrollada por Realpe et al. (2007). Los rendimientos por larva de G. mellonella fueron mayores con las especies de Heterorhabditis. Con la especie nativa Heterorhabditis sp. (Gua 31) se tuvo un rendimiento de 137.412 ± 18.320 JI/larva de G. mellonella; para H. bacteriophora fue de 121.143 JI/larva y con Steinernema sp., fue de 81.321 ± 28.023 JI/larva. En general estos rendimientos se consideran buenos si se comparan con datos registrados por otros autores (Bustillo 1976; Molina y López 2001). Lindegren et al. (1993) reportan rendimientos con Steinernema carpocapsae de 190000 JI/larva y consideran que factores como el tamaño del hospedero, la especie de nematodo y el método de producción influyen el rendimiento.
Determinación de la virulencia de los nematodos entomopatógenos
En las evaluaciones de campo las ninfas encontradas muertas llevadas al laboratorio mostraron los signos característicos de infección por nematodos, para el caso de Heterorhabditis sp., una coloración anaranjada a rojo escarlata en las ninfas y en Steinernema sp., flacidez sin cambio de coloración. Los resultados de los experimentos de virulencia a las especies de nematodos evaluadas se presentan en las tablas 1 a 4.
Mortalidad (%) en ninfas de A. varia causada por especies de nematodos entomopatógenos, aplicados en dosis de 1,5 x 10¹¹ JI/ha (23,4 °C; 81,7% HR; 6,7 mm de precipitación). (Experimento 1).
NV: Número de ninfas vivas al inicio.
Datos en la misma columna seguidos de la misma letra, no difieren significativamente de acuerdo con la prueba de Duncan (P = 0,05).
Mortalidad (%) en larvas de G. mellonella 30 días después de la aplicación de los JI.
Mortalidad (%) en ninfas de A. varia después de la aplicación de diferentes especies de nematodos entomopatógenos, en dosis de 5x10¹⁰ JI/ha, en un cultivo de caña de azúcar (22 °C, 81,1% HR; 10,2 mm de precipitación). (Experimento 2).
NV: Número de ninfas vivas al inicio.
Datos en la misma columna seguidos de la misma letra, no difieren significativamente de acuerdo con la prueba de Duncan (P = 0,05).
Mortalidad (%) en larvas de G. mellonella 30 días después de la aplicación de los JI.
Mortalidad (%) en ninfas de Aeneolamia varia después de la aplicación de Heterorhabditis bacteriophora en diferentes dosis, en un cultivo de caña de azúcar (23,1 °C; 79,1% HR; 1,2 mm de precipitación). (Experimento 3).
Número de ninfas vivas al inicio.
Datos en la misma columna seguidos de la misma letra, no difieren significativamente de acuerdo con la prueba de Duncan (P = 0,05).
Mortalidad (%) en larvas de G. mellonella 30 días después de la aplicación de los JI.
Mortalidad (%) en ninfas de Aeneolamia varia después de la aplicación de Heterorhabditis sp. (Gua 31) en diferentes dosis, en un cultivo de caña de azúcar (23,1 °C, 80,2 % HR, 4,7 mm de precipitación). (Experimento 3).
Ninfas vivas al momento de la aplicación de los JI.
Datos en la misma columna seguidos de la misma letra, no difieren significativamente de acuerdo con la prueba de Duncan (P = 0,05).
Discusión
Los resultados de esta investigación para el control de A. varia en un cultivo de caña, indican que las especies de Heterorhabditis son más eficaces que las especies de Steinernema evaluadas. Ferrer et al. (2004) encontraron que H. bacteriophora causó 71,4% de mortalidad sobre ninfas de A. varia en dosis de 1 x 10⁹ JI/ha, sin embargo sugieren evaluar dosis más altas, bajo condiciones de densidades mayores de población del salivazo.
La mayor eficacia de las especies de Heterorhabditis en el control de insectos, se atribuye a que ellos pueden penetrar más fácilmente los insectos que otras especies de nematodos (Bedding et al. 1982). Normalmente se indica que la penetración de nematodos en insectos se hace a través del ano, espiráculos y vía oral, sin embargo, esta última se hace muy difícil en insectos con hábito chupador, como son los salivazos. Una mayor eficacia del género Heterorhabditis, se explica por los hallazgos de Aguillera (2001) quien encontró que estos pueden penetrar a través de la cutícula del hospedero, con la ayuda de un pequeño diente que poseen.
Las diferencias en mortalidad en los experimentos en este estudio, pudo deberse a variaciones en la humedad en el suelo, que afectan la viabilidad y el desplazamiento de los nematodos. Downing (1994) en aplicaciones de H. bacteriophora (C1 strain) en pastos para el control de Popillia japonica Newman y Cyclocephala borealis Arrow, encontró que cuando las parcelas se sometían a irrigación antes del tratamiento y de nuevo 24 horas después de la aplicación, se incrementaba la eficacia del nematodo.
Persistencia de nematodos
En las observaciones hechas en los tres experimentos sobre la sobrevivencia de las especies de nematodos evaluadas, se encontró que al menos continúan viables en el suelo al cabo de 30 días (Tablas 1 a 3). Si se analiza la mortalidad ocurrida en los diferentes tratamientos como un indicativo de su presencia (persistencia), se puede decir que en general prevalecieron las especies de Heterorhabditis, y que cuando las dosis son mayores se muestra una tendencia a ocurrir una mayor mortalidad en las larvas indicadoras de G. mellonella.
Los resultados muestran la potencialidad de Heterorhabditis bacteriophora y Heterorhabditis sp. (Gua 31), en el control de A. varia en cultivos de caña de azúcar en el Valle del Cauca. Sin embargo, es necesario adelantar estudios adicionales para determinar las condiciones que favorezcan más su actividad controladora, en plantaciones comerciales de caña de azúcar.
Footnotes
Agradecimientos
Los autores expresan su agradecimiento a Cenicaña y al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia, por la cofinanciación de esta investigación a través del proyecto 212-2008G42065-6618.