Abstract
The development of the cassava genetic map has promoted research such as the finding of genes associated with the resistance of pests that diminish the production and quality of the crop. Molecular tools, such as markers can facilitate the identification of the genes that dominate resistance to pests this is the specific case of the presence of resistance to the green mite
Introducción
La yuca,
En Colombia, el ácaro verde de la yuca
En el manejo de esta plaga, los acaricidas son la primera opción, aunque están lejos de ser una alternativa económica, ambientalmente segura y compatible con el Manejo Integrado de Plagas (MIP). En contraste, la resistencia de planta hospedera (RPH), altamente se ajusta a otros métodos de control y puede constituirse en el pilar del MIP que permita prevenir y controlar las pérdidas causadas por AVY. Así mismo, se cuenta con aportes al conocimiento y entendimiento de la naturaleza de los genes que confieren resistencia mediante el mejoramiento genético tradicional complementado con el uso de novedosas técnicas moleculares. Los marcadores moleculares basados en ADN, AFLP (por su sigla en inglés, amplified fragment length polymorphism) y RAPD (random amplified polymorphic DNA) han sido usados para escanear variaciones amplias del genoma y demostrar la existencia de patrones de dominancia heredables (Okogbenin y Fregene 2001; Okogbenin et al. 2006). Más recientemente, mediante el uso de marcadores específicos de QTL (quantitative trait loci) y SSR (simple sequence repeat) se obtuvo el mapa genético de la yuca y se detectaron genotipos y sistemas multialélicos codominantes asociados a la tolerancia y resistencia de dos importantes enfermedades, como el mosaico africano de la yuca y la bacteriosis vascular (Okogbenin y Fregene 2001; Okogbenin et al. 2006). Al correlacionar o asociar marcadores con las respuestas fisiológicas aportadas por la planta ante la presencia de una plaga e incrementar, mediante simple selección mendeliana, su capacidad de resistencia a ésta, se ofrecen a los agricultores del mundo genotipos resistentes y de mayor rendimiento. Por ejemplo Burbano et al. (2007) al comparar niveles de resistencia entre genotipos silvestres y variedades comerciales, encontraron que el silvestre
Materiales y Métodos
El trabajo comprendió las siguientes etapas: Evaluación fenotípica en campo del comportamiento y respuesta de las plantas de yuca al ataque del ácaro verde, selección de variedades resistentes y susceptibles al ataque del ácaro verde según escala establecida para el daño ocasionado por esta plaga, evaluación de 500 cebadores para determinar cuantos y cuales se encontraron asociados a la característica de resistencia a AVY y la valoración de la significación del coeficiente de correlación para determinar si hay o no asociación entre los marcadores moleculares seleccionados y la resistencia al ácaro verde.
Evaluación fenotípica de progenie (retrocruce BC1) de yuca al ácaro verde
Para este estudio se emplearon cuatro familias de yuca (CW 65, 66, 67, 68) progenies del retrocruce (BC1) provienentes del cruzamiento inicial de dos variedades contrastantes, la accesión MFla 437-007 (
Selección de la población segregante de yuca para AVY
Los genotipos contrastantes se seleccionaron teniendo en cuenta la escala de evaluación para daño causado por AVY propuesta por Lenis et al. (1993) (Tabla 1).
Escala de síntomas de daño ocasionado por ácaro verde AVY en yuca.
Selección de individuos resistentes/susceptibles a AVY para conformar grupos contrastantes
Una vez seleccionados los genotipos segregantes y teniendo en cuenta la evaluación fenotípica, realizadas en los lotes de CIAT y donde se determinó el nivel de infestación en hojas, se escogieron individuos que exhibieran, de forma independiente, resistencia y susceptibilidad a AVY, teniendo en cuenta la escala de daño descrita anteriormente se conformaron dos grupos contrastantes, uno con altos niveles de resistencia (daño con sintomatología entre 1,0 y 2,9) y el otro con altos niveles de susceptibilidad (con sintomatología entre 4,1 y 5,9).
Análisis de grupos segregantes (BSA)
Luego de seleccionados los individuos segregantes y confirmada su respuesta a AVY, se conformaron dos grupos contrastantes de individuos según la severidad observada en la evaluación fenotípica, basada en la escala de daño ya establecida. Se integró un grupo o bulk de individuos resistentes (sintomatologia 1,0 y 2,0) y otro de susceptibles (sintomatologia 4,0 y 5,0). Se hizo extracción de ADN de los individuos seleccionados, siguiendo el protocolo de Dellaporta (1983), se visualizó la calidad y se cuantificó la concentración del ADN extraído y se diluyó hasta obtener una concentración final de 10 ng/µl. En tubos eppendorff se mezclaron estas dilusiones de ADN, en uno el de los individuos resistentes y por separado las dilusiones de ADN de los individuos susceptibles, con el fin de conformar los dos grupos contrastantes y asi realizar el análisis de grupos segregantes (Michelmore et al. 1991). Finalmente, el ADN de los parentales junto con el de los grupos contrastantes fueron evaluados utilizando 500 marcadores microsatélites (Tabla 2) que fueron diseñados con base en ADN.
500 marcadores SSR evaluados en los parentales, los grupos contrastantes e individuos resistentes y susceptibles.
En el cóctel de PCR se utilizaron, 3ul de ADN (10 ng/µl), 0,3 µl de taq-polimerasa (5U), 0,3 µl de cada cebador (10 µM), 0,6 µl de dNTPs (200 µM) y 1,5 µl de tampón 10X, en un volumen de 15 µl con agua HPLC en cada reacción. Los productos de la amplificación de los parentales y los grupos resistentes y susceptibles fueron visualizados en geles de poliacrilamida al 4% de úrea en proporción 29:1 (acrilamida: bisacrilamida) en una electroforesis de tipo vertical, corridos a 1.370 v 90 mA y 80 W, durante 45 minutos, aproximadamente.
La evaluación de los 500 marcadores, tanto en los parentales como en los grupos contrastantes, permitió seleccionar aquellos asociados a la característica de resistencia al AVY (polimórficos) es decir, cuyo patrón de bandas mostró diferencias en relación con los padres. Esta selección fue respaldada con el patrón observado en los grupos contrastantes.
Identificación de SSR polimórficos en grupos Resistentes y Susceptibles
Se evaluó cada uno de los individuos de los grupos contrastantes con aquellos marcadores microsatélites seleccionados como candidatos y así se pudo confirmar el polimorfismo entre los parentales y los individuos resistentes y susceptibles. Lo anterior sirvió para escoger marcadores que determinaran la asociación entre el microsatélite y la resistencia al AVY.
Asociación entre SSR y respuesta fenotípica de la familia segregante a AVY
De acuerdo con la reacción de los individuos a AVY en campo y teniendo en cuenta los valores promedio de la evaluación fenotípica dentro de cada parcela o grupo de repeticiones, se utilizaron dos grupos de rangos según la escala de severidad de la enfermedad agrupándolos en dos categorías para el análisis estadístico, teniendo como modelos análogos de clasificación las categorías de agresividad de AVY en yuca. En la evaluación genotípica, se asignó 1 o 0 para denotar, respectivamente, presencia o ausencia de la banda o marcador. Se generó una matriz binaria la cual fue analizada con los paquetes estadísticos SAS (V.6) y SPSS (v-11.6) en conjunto con los datos de la evaluación fenotípica de campo, buscando la asociación entre las bandas y la respuesta fenotípica a AVY, bajo la hipótesis de la inexistencia de asociación entre el marcador molecular y la resistencia a AVY. Se realizó una correlación, entre la severidad del daño ocasionado por el AVY y la presencia o ausencia del marcador candidato, la cual fue verificada mediante una prueba de chi-cuadrado, para valorar la significación del coeficiente de correlación y así determinar si había o no asociación entre los marcadores moleculares seleccionados y la resistencia al ácaro verde. Los datos fueron analizados mediante chi-cuadrado al 0.05% de significancia.
Resultados y Discusión
Distribución de frecuencias de AVY en yuca evaluadas por expresión fenotípica en campo
En este estudio, se muestra la distribución de la frecuencia de AVY en la población segregante (Retrocrucel) correspondiente a las progenies de las familias CW 65, 66, 67 y 68. Los individuos se agruparon como una sola población, de 120 individuos seleccionados 18 (15%) fueron resistentes, 49 (41%) susceptibles y 53 (44%) intermedios (Fig.1). Estos últimos fueron descartados en esta evaluación. La menor proporción de fenotipos resistentes y susceptibles en la población segregante sugiere que existe una poca contribución génica al papel que puede ejercer el ambiente en la expresión de la característica de resistencia, esto quiere decir que diversos factores ambientales estarían desempeñando un papel importante en la expresión de la resistencia al daño por AVY.
Distribución de frecuencia de AVY en individuos producto del retrocruce 1 (CW 65, 66, 67) de acuerdo al nivel de resistencia a
Análisis de grupo segregante utilizando SSR en la población BC1 seleccionada
El análisis de los grupos segregantes en la población evaluada (CW) con los 500 marcadores microsatélites SSRY (Tabla 2), cuyo objetivo principal fue encontrar bandas (marcadores) asociadas con la resistencia al ácaro verde de la yuca, permitió observar que el polimorfismo se expresa en tres formas distintas (Fig. 2). Este tipo de resultado concuerda con lo reportado por Hurtado et al. (2004) en la detección de resistencia al añublo bacterial de la yuca en Colombia donde, al igual que en nuestro trabajo, se observaron diferencias entre el parental resistente y susceptible, diferencia igualmente observable en los grupos contrastantes. Se observaron diferencias entre los grupos contrastantes y además entre el parental resistente con el parental susceptible (Fig. 2A). Esto indica que aunque existe un polimorfismo asociado es posible que corresponda a otro tipo de asociación. Por otro lado se observó la presencia de una banda segregada por el parental resistente al grupo de individuos resistentes (Fig. 2B) que permite suponer un polimorfismo de presencia de banda para el gen resistente lo que, a su turno, sugiere que la banda visualizada puede estar asociada con la resistencia al AVY y que los marcadores evaluados, generadores del polimorfismo, son potenciales candidatos marcadores SSR. Además, se observaron también diferencias entre el parental resistente con el parental susceptible y los dos grupos contrastantes (Fig. 2C), lo que sugiere que la banda presente en el parental susceptible y los grupos contrastantes sea expresión de otra característica con poco o sin interés en la resistencia a AVY.
Polimorfismos detectados con los marcadores evaluados SSR en el análisis de grupos segregantes. A. ausencia de banda en el resistente. B. presencia de banda en el resistente. C. presencia de banda en los grupos y el parental susceptible. PR-PS = parental resistente y susceptible, BR-BS = Grupo resistente y susceptible.
De los 500 marcadores SSR evaluados, 11 fueron seleccionados por presentar la banda en el parental y el grupo contrastante, resistentes y, por tanto, se escogieron como posibles marcadores moleculares asociados con la resistencia al ácaro verde de la yuca.
Evaluación de SSR polimórficos en individuos que conforman grupos contrastantes
De la evaluación de los 11 marcadores microsatélites SSRY en los individuos que conforman los grupos contrastantes, SSRY 11, SSRY 181, NS 346, NS 1099 y NS 1141, mostraron diferencias entre individuos resistentes y susceptibles, i.e. los grupos contrastantes, y fueron considerados como marcadores candidatos. Durante la visualización de estos cinco marcadores microsatélites polimórficos evaluados con los individuos considerados como resistentes y susceptibles al daño mecánico causado por
Geles de poliacrilamida que muestran la amplificación de los parentales e individuos que conforman los grupos contrastantes con los seleccionados como marcadores candidatos.
Asociación entre SSRY y NS y la resistencia al ácaro verde de la yuca
Los resultados de las correlaciones nos muestran que de los tres marcadores microsatélites seleccionados sólo NS 1099 y NS 346 presentan relación entre el daño mecánico causado por el AVY y la característica genética de los individuos que conforman las familias CW 66 y CW 67. Se observa, además, que los valores de la asociación entre los datos fenotípicos y genotípicos fueron altos (Tabla 3). Estos dos marcadores moleculares mostraron mayor grado discriminatorio, lo cual indica que fue posible determinar que el 61% de los individuos que en campo se presentaron con bajo nivel de incidencia al AVY, molecularmente segregaron una banda especial, asociada a la resistencia.
Resultados de los análisis estadísticos, correlación y regresión lineal realizados con los tres marcadores candidatos a los individuos CW.
Correlación significativa P < 0.01.
Al comparar las frecuencias fenotípicas obtenidas, a través de la evaluación del daño por
Resultados de la prueba de independencia de las familias CW 66 y CW 67 con los dos marcadores seleccionados como candidatos por presentar polimorfismo.
Finalmente, aunque no fue posible determinar la ubicación de los tres marcadores candidatos en el mapa de yuca, es plausible sugerir una clara asociación entre éstos y la resistencia al ácaro verde de la yuca. La segregación presentada por CW 66 y 67 y la naturaleza contrastante de los parentales, permite proponer su utilización en estudios posteriores de evaluación con miras a generar un nuevo mapa de yuca. Esto permitiría localizar nuevos marcadores que expliquen la resistencia de
Footnotes
Agradecimientos
Al personal del laboratorio de Genetica de Yuca y de Entomología de Yuca por toda la colaboración para el desarrollo de este trabajo. Al Centro de Investigaciones de Agricultura Tropical CIAT.