Abstract
Laboratory tests have been conducted in order to ascertain the possibility of using the bacteria Paenibacillus polymyxa expressing the Bacillus thuringiensis Cry1C toxin as a delivery system for Cry proteins that can be used to control the Spodoptera littoralis noctuid on cotton crops. We have studied the insecticidal activity on first instar larvae of S. littoralis and the persistence of the transformed strain of P. polymyxa, compared with the unmodified strain and B. thuringiensis var. aizawai naturally expressing the toxin. The results show that the transformed bacteria was more toxic (LC50-7.04x107 spore+crystal/ml) than B. thuringiensis var. aizawai (LC50=8.47x107 spore+crystal/ml). High levels of persistence into foliar tissues and insecticide activity were found, at least until 720 hours after foliar treatment. On the other hand, its application in the plant increases the amount of nitrogen and improves soil nitrogenase activity compared to untransformed P. polymyxa.
Introducción
Bacillus thuringiensis (Berliner, 1915) (Bt) es una bacteria Gram-Positivo que se caracteriza por producir una inclusión parasporal durante la esporulación formada por uno o más cuerpos cristalinos que contienen las proteínas insecticidas (Höfte y Whiteley 1989; Schnepf et al. 1998). Estas proteí- nas, llamadas delta-endotoxinas o Cry, son tóxicas para in- sectos de los órdenes Lepidoptera (Brock y Madigan 1988), Coleoptera (Dulmage y Aizawa 1982; Chiang et al. 1986) y Diptera (Lambert y Peferoen 1992) y constituyen la base del insecticida biológico más difundido a nivel mundial (Brar et al. 2006).
Los avances en la genética de Bt permiten el desarrollo de su máxima potencialidad como insecticida mediante ma- nipulación de genes cry (que codifican determinadas toxinas) con objeto de ampliar su espectro de actividad, aumentar su toxicidad mediante efectos sinérgicos o aditivos (Crickmore et al. 1995; Lee et al. 1996) o para la producción de organis- mos genéticamente modificados.
Un problema relacionado con los preparados comercia- les a base de Bt es su limitada persistencia y estabilidad en campo (Cohen 1991) y para paliar este inconveniente se han puesto en práctica técnicas de inserción de genes cry específi- cos en otros organismos con capacidad de colonizar la planta huésped del fitófago, de tal manera que los organismos trans- formados puedan sintetizar de forma continua cantidades su- ficientes de proteína Cry para evitar el daño causado por el insecto (Obukowicz et al. 1986; Gelernter 1990; Stock et al. 1990; Waalwijk et al. 1991; Lampel et al. 1994).
Sin embargo, la introducción de genes cry en bacterias distintas a B. thuringiensis acarrea inconvenientes debido a la inestabilidad de la característica introducida (Tiedje et al. 1989). La utilización de bacterias del mismo género que Bt permite solventar estos inconvenientes y reducir los proble- mas asociados a la expresión de los genes cry (Perlak et al. 1991; Fujimoto et al. 1993). Además, se ha visto que cepas transformadas de Bacillus megaterium de Bary, 1884; Bacillus subtilis (Ehrenberg 1835) y Bacillus licheniforme (Weig- mann, 1898) que expresan proteínas Cry especificas de Bt pueden tener una persistencia prolongada y mejorar su efica- cia insecticida (Bora et al. 1994; Theoduloz et al. 2003).
El lepidóptero Spodoptera littoralis (Boisduval, 1833) (Noctuidae), conocido comúnmente en España como "ros- quilla negra", es una especie polífaga y de distribución me- diterránea que causa daños de importancia económica en numerosos cultivos y plantas hortícolas. En Egipto es consi- derada como la plaga principal del cultivo de algodón (Hosny et al. 1986; Hatem et al. 2009) y en España sus poblacio- nes son abundantes en las regiones del Levante y Andalucía (Gómez de Aizpurúa y Arroyo Varela 1994). Esta especie, como otras del mismo género, mostraron en principio poca susceptibilidad a los primeros productos comerciales de Bt, pero luego se han aislado cepas naturales pertenecientes a las variedades entomoocidus y aizawai (Navon et al. 1983; Bro- za et al. 1984) con mayor capacidad tóxica para las larvas de estos noctuidos, y más recientemente se han obtenido cepas transformadas genéticamente que son más activas (Kalman et al. 1995). Se sabe que las especies de Spodoptera poseen en la membrana de las células columnares del mesenterón un receptor específico de la proteína Cry1C (Sanchis et al. 1994) responsable de esta mayor susceptibilidad.
A partir de la bacteria fijadora de Nitrógeno Paenibacillus polymyxa (Prazmowski, 1880) que habita la rizosfera del algodón, se ha construido una cepa (NMO10) que expresa la proteina Cry1C y que presenta toxicidad para larvas de S. littoralis (Ibrahim et al. 2006; Ibrahim y Omar 2009).
Este trabajo estudia la actividad insecticida y la persisten- cia de la bacteria P. polymyxa que expresa la toxina Cry1C de Bt, para conocer su idoneidad como un sistema de aplicación de toxinas Cry que pueda ser utilizado en aplicaciones folia- res para el control de S. littoralis en el cultivo de algodón. Así mismo, se determina si esta bacteria transformada mantiene su capacidad fijadora de nitrógeno.
Materiales y Métodos
Material biológico
Se usaron Paenibacillus polymyxa trans- formada con cry1C de Bt, la cepa natural de Paenibacillus polymyxa (ambas obtenidas por la Dra. Nahed Abdel Al-Ghaffar Ibrahim del Agriculture Genetic Engineering Research Insti- tute de Egipto) y Bacillus thuringiensis var. aizawai reaisla- do del producto comercial Xantari® GD: 15% (15 millones U.I./gr) p/p suministrado por Kenogard, S.A (Barcelona). La técnica de obtención de la cepa de P. polymyxa transformada ha sido descrita por Ibrahim et al. (2008) y el gen cry1C fue obtenido por el laboratorio del Dr. Donald H. Dean (Univer- sidad de Ohio, USA).
Las bacterias se multiplicaron en medio de cultivo T3 [5g/l de peptona, 1,5g/l de extracto de levadura, 0,005g/l de MnCl2 y solución tampón de fosfato sódico 0,5M (pH 6,8)] y para la bacteria transformada se añadió al medio kanamicina (100µg/ml). El periodo de incubación fue de siete días, tras lo cual se confirmó que los cultivos estaban completamente lisados y se procedió a la centrifugación a 10000rpm durante 15min a 4°C en tubos de polipropileno de 30ml. El sedimento se lavó en agua bidestilada y el precipitado final se obtuvo como una suspensión en agua estéril de espora-cristal que se conservó a -20°C hasta su uso. La riqueza de las suspensio- nes en número de esporas y cristales por ml (esp+cri/ml), se determinó mediante recuentos en cámara Neubauer.
Las larvas de S. littoralis proceden de una población man- tenida en condiciones de insectario (26°2°C, 60±5% HR y fotoperiodo de 16 horas de luz) que fueron alimentadas con dieta semisintética a base de harina de alfalfa modificada de Poitout y Bues (1974).
Bioensayos de toxicidad
En estos bioensayos se comparó, en condiciones de insectario, la toxicidad de P. polymyxa transformada (Ppt) y de B. thuringiensis var. aizawai (Bt) que contiene el gen cry1C de forma natural. Se emplearon cinco concentraciones de Ppt, seis concentraciones de Bt y un testigo para cada tipo de bacteria, utilizando 10 larvas de primer estadio (L1) por repetición, con cinco repeticiones para Ppt siendo necesario un mayor número de repeticiones (10) para Bt con el fin de que el ajuste de la recta de regre- sión fuera estadísticamente aceptable. Las concentraciones de Ppt fueron 6,12x106; 18,40x106; 55,06x106; 165,30x106 y 495,90x106 esp+cri/ml y las de Bt 0,68x106; 2,10x106; 6,16x106; 18,47x106; 55,40x106 y 166,20x106 esp+cri/ml.
El complejo espora-cristal se suministra a las larvas de S. littoralis depositando 200µl de la suspensión sobre dieta pre- viamente vertida en el fondo de cajas de plástico de 39mm de diámetro y 25mm de altura. Después de dejar secar, se intro- ducen 10 larvas neonatas por caja. La duración de bioensayo es de siete días.
Bioensayos de supervivencia y persistencia
Como inó- culos se utilizaron las bacterias P. polymyxa transformada y P. polymyxa natural, que procedían de la multiplicación en medio T3 antes descrita y que posteriormente se liofilizaron hasta su uso. Los liofilizados se resuspendieron en agua has- ta una concentración final de 1000ppm, a los que se añadió goma arábiga (1%) y Tween-20 (0,01%). Estas suspensiones fueron aplicadas en pulverización foliar sobre plantas de al- godón de cuatro semanas de edad mantenidas en condiciones de semicampo. Finalmente se dejaron secar 2 horas antes de iniciar la toma de muestras para los bioensayos. Para ello, en diferentes periodos después de la inoculación de las plantas (2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 336, 504 у 720 horas) se eligieron al azar dos hojas, de las cuales una de ellas se usaron para la determinación de la supervivencia de la bacteria y la otra para el ensayo de persistencia de la actividad insecticida.
Para determinar la supervivencia de las bacterias en el in- terior de los tejidos foliares, tras su desinfección superficial con hipoclorito sódico al 10%, se cortaron en pequeños tro- zos que se sometieron a inmersión y agitación suave en 50ml de una solución estéril de MgSO4 100mM durante 15min para la liberación de la bacteria fijada al tejido. Con cada lí- quido resultante (suspensión madre) se hicieron tres dilucio- nes (1/10, 1/100 у 1/1000) у cada suspensión fue cultivada en placa (2 placas/suspensión) con medio LB sólido (triptona 10g/l, levadura 5g/l, cloruro sódico 5g/l y agar 15g/l) y se in- cubaron a 30°C durante la noche. Finalmente se calculan las Unidades Formadoras de Colonias (UFC) como valor medio de los recuentos de las placas y se determinan los valores de UFC/g peso seco (Sudha et al. 1999).
Para evaluar la persistencia de la toxicidad de P. polymyxa transformada, las hojas de algodón seleccionadas se coloca- ron separadamente en una placa Petri (16cm de diámetro y 3,5cm de altura) en condiciones de insectario y se infestaron artificialmente con 10 larvas neonatas de S. littoralis. A las 72 horas se realizó el control de mortalidad larvaria. Para cada tiempo después de la aplicación se realizaron tres repeticio- nes, utilizando los valores medios de mortalidad para deter- minar la toxicidad correspondiente.
Contenido de nitrógeno en planta y actividad nitrogenasa en suelo
El nitrógeno total se determinó con plantas tratadas por pulverización foliar con 1000ppm de P. polymyxa trans- formada y de P. polymyxa natural. Dos semanas después de la inoculación se tomaron muestras de la parte epigea que se analizaron con el método Micro Kjeldahl, usando una mezcla de H2SO4+HClO3 (1:1) de acuerdo al procedimiento de Page et al. (1982). El contenido de N se calculó mediante la fórmu- la: mg N/planta = %N × Peso seco (g)/planta × 10.
Para ambas bacterias se determinó también la actividad nitrogenasa en muestras de suelo que fue artificialmente in- festado con 1000ppm de P. polymyxa transformada y de P. polymyxa natural, siguiendo la técnica de reducción del ace- tileno (ARA) a partir de muestras de 100gr de suelo activado con dos fuentes de carbono e incubado a 28°C durante 72h. Las muestras se transfirieron a tubos de 300ml y se analiza- ron por cromatografía de gases según el método descrito por Hardy et al. (1973) y Somasegaran y Hoben (1985). A partir de las cantidades de etileno (en µmoles) de las muestras, se determinan los valores expresados en nanomoles de etileno/ gr/h.
Análisis estadísticos
Los datos de mortalidad larvaria en los bioensayos de toxicidad se sometieron a análisis de regresión Probit (Finney 1971) para determinar las ecuaciones lineales que relacionan concentración-mortalidad y a partir de ellas se calcularon las concentraciones letales medias (CL50). Para los análisis de regresión y la comparación de las rectas se utilizó el programa POLO (Russell et al. 1977). Los datos de cantidad de Nitrógeno y de actividad nitrogenasa fueron so- metidos a análisis de la varianza y las medias se compararon con la prueba de la Minima Diferencia Significativa (LSD) al 5% de significación.
Resultados y Discusión
Evaluación de la toxicidad
Se determinó la mortalidad de larvas de primer estadio de Spodoptera littoralis tratadas con P. polymyxa transformada y B. thuringiensis var. aizawai (Tabla 1).
Análisis de regresión Probit y CL50 de Paenibacillus polymyxa transformada (Ppt) y Bacillus thuringiensis var aizawai (Bt) para larvas de primer estadio de Spodoptera littoralis.
xβ = test para la bondad del ajuste.
Los valores de la prueba xβ indican un buen ajuste de am- bas rectas, cuyas pendientes difirieron entre sí (test de parale- lismo xβ(1)=14,87 (p<0,001), siendo significativamente ma- yor la pendiente en el tratamiento con P. polymyxa transfor- mada. Esta diferencia se atribuye a la menor heterogeneidad de la población de la bacteria transformada en comparación con la cepa de B. thuringiensis.
La toxicidad de P. polymyxa transformada se caracterizó por una CL50 de 7,04x107 esp+cri/ml para larvas de primer estadio de S. littoralis; este valor fue menor que el de B. thuringiensis var. aizawai de 8,47x107 esp+cri/ml. No obstante, como se deduce por el solape de los intervalos fiduciales, ambos valores no difirieron significativamente. A resultados similares llegaron Ibrahim y Omar (2009) al comparar la toxicidad de P. polymyxa transformada con B. thuringiensis var. entomocidus sobre larvas neonatas de S. littoralis.
Bora et al. (1994) utilizaron la cepa RS1 de B. megaterium aislada de la filosfera de las plantas de algodón para introducir el gen crylAa de la cepa HD-1 de B. thuringiensis var. kurstaki. La actividad insecticida del organismo transfor- mado en larvas de Helicoverpa armigera (Hübner, 1805) fue similar a la cepa HD1 pero su efecto persistió durante más tiempo ofreciendo una mejor protección de las plantas. Así mismo, cepas transformadas de B. subtilis y B. licheniforme que expresan Cry1Ab y habitan de forma natural en el filo- plano de plantas del tomate, muestran una actividad insec- ticida contra el lepidóptero Tuta absoluta (Meyrich, 1917) similar a una cepa de B. thuringiensis que expresa de forma natural la proteína (Theodulos et al. 2003). La utilización de estas bacterias colonizadoras de plantas, transformadas gené- ticamente para tener acción insecticida contra plagas, se ha venido desarrollando desde la década de los 90 (Gelernter y Schwab 1993), sin que hasta ahora se hayan encontrado efec- tos ambientales adversos en la evaluación de su bioseguridad en campo.
Supervivencia de P. polymyxa
En las hojas superficialmen- te esterilizadas se encontraron altos niveles de supervivencia de la bacteria establecida en los tejidos foliares al menos has- ta 720 horas después del tratamiento (Tabla 2). Los valores en UFC/g peso fresco mostraron oscilaciones entre periodos consecutivos, probablemente debido a que las determinacio- nes procedían de una sola muestra de hoja. No obstante, la supervivencia de la bacteria transformada se extendió duran- te los 30 días de duración del ensayo, al igual que la bacteria no transformada. Resultados semejantes se han obtenido en caña de azúcar (James y Olivares 1998) y arroz (James et al. 2002). En cultivos en invernadero Denise et al. (2002) encuentran bacterias endófitas colonizando sus plantas hués- pedes originales 42 días después de la inoculación a unos ni- veles de 3,5-7,7×10¹º UFC/g peso fresco.
Supervivencia en el tejido foliar del algodón de Paenibacillus polymyxa transformada (con el gen cry1C) y Paenibacillus polymyxa no transformada, después de pulverización foliar en plantas de algodón.
Persistencia de la actividad insecticida
Los porcentajes de mortalidad oscilaron entre 46,7 y 100%, y al final del ensa- yo la media estuvo alrededor del 50% de las larvas tratadas (Fig. 1). Datos similares han sido señalados por Ibrahim et al. (2006) y Sudha et al. (1999) con el también lepidóptero Scirpophaga incertulas (Walker, 1863) en arroz. La cepa RS1 de B. megaterium transformada con el gen crylAa de B. thuringiensis var. kurstaki persiste en la superficie de las hojas de algodón durante más de 28 días, mientras que la cepa de B. thuringiensis desaparece completamente siete días después de la inoculación. La actividad insecticida de la cepa trans- formada en larvas de H. armigera persistió a altos niveles durante tres semanas desde la aplicación (Bora et al. 1994). Así mismo, cepas transformadas de B. subtilis y B. licheniforme que expresan Cry1Ab fueron capaces de sobrevivir en las hojas del tomate durante más de 45 días (Theoduloz et al. 2003).
Persistencia de la actividad insecticida de Paenibacillus polymyxa transformada (con el gen cry1C), sobre larvas de primer estadio de Spodoptera littoralis después de pulverización foliar en plantas de algodón.
Los resultados indican que la toxicidad de la bacteria per- manece durante un largo periodo, en contraste con la pérdida mucho más rápida de actividad de las pulverizaciones con Bt convencional que se degrada significativamente en 24-48 horas (Pusztai et al. 1990). La mayor persistencia puede ser una cualidad como bioinsecticida cuando se tratan poblacio- nes larvarias heterogéneas, como las que suelen caracterizar los ataques de S. littoralis, aunque la presencia de residuos de bajas dosis en la planta pueden contribuir a la aparición de resistencia (Nester et al. 2002). En estas circunstancias, los enemigos naturales pueden influir también en el desarrollo de resistencia a la bacteria por preferir los intoxicados-suscepti- bles o los saludables-resistentes (Schnepf et al. 1998).
Contenido de Nitrógeno y actividad nitrogenasa
En las plantas tratadas con P. polymyxa transformada el contenido medio de Nitrógeno fue de 52,93mg/planta, significativa- mente mayor (F=34,5; gl=2; P=0,0005) que el de 28,79mg en las tratadas con P. polymyxa no transformada (Fig. 2). En cuanto a la actividad nitrogenasa (ARA) (Fig. 3), se encon- traron diferencias significativas entre tratamientos (F=75,4; gl=2; P=0,0001) de tal forma que en suelos con P. polymyxa transformada la actividad fue mayor que en suelos con P. polymyxa no transformada. Por tanto, en ambos casos la bacte- ria transformada mostró mayor actividad fijadora de Nitróge- no en las plantas de algodón que la propia bacteria no trans- formada, lo cual es un resultado no esperado cuyas causas han de ser investigadas. Gyaneshwar et al. (2001) detectaron también actividad nitrogenasa en plantas de arroz inoculadas con la bacteria fijadora de nitrógeno Serratia marcescens (Bizio, 1823).
Contenido total de Nitrógeno en plantas de algodón tratadas en pulverización foliar con Paenibacillus polymyxa transformada (con el gen cry1C) y no transformada.
Actividad nitrogenasa en suelo tratado con Paenibacillus polymyxa transformada (con el gen cry1C) y no transformada.
En resumen, los resultados indican buenas aptitudes de la bacteria P. polymyxa que expresa la toxina Cry1C de B. thuringiensis, como bioinsecticida y que serviría también como biofertilizante en programas de Producción Integrada para el control de S. littoralis. Por un lado, la bacteria trans- formada tiene similar actividad tóxica que B. thuringiensis var. aizawai sobre larvas de primer estadio de S. littoralis y en pulverizaciones foliares presenta alta persistencia y super- vivencia al mismo tiempo que favorece la capacidad fijadora de nitrógeno en la planta; por otro lado, su aplicación mejora la actividad nitrogenasa en suelo, en comparación con la bac- teria P. polymyxa no transformada.
Footnotes
Agradecimientos
A la Agencia Española de Cooperación Internacional para el Desarrollo (AECID) por la concesión de una Beca de Docto- rado al primer autor.