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Abstract

Spanish

The ability of the larval midgut protease extracts from Culex quinquefasciatus and trypsin to process Bacillus thuringiensis subsp. medellin CryllBb toxin was investigated. The activity of midgut proteases increase with an increment in pH being the highest activity obtained at pH 10.6. A time course study showed partial fragmentation of the protein ultimately ending in the production of protease-resistant core fragments of relative molecular masses of 30 and 33 kDa. Proteases with trypsin specificity were detected in C. quinquefasciatus larval midgut extracts. This activity was detected by N-terminal amino acid sequence analysis of the Bacillus thuringiensis subsp. medellin Cry11Bb toxin proteolytic fragments. In vivo, the mosquito larvae processed the inclusions generating three fragments. The fragments fully retain their toxicity to C. quinquefasciatus first instar larvae. These data indicate the possible role of midgut proteases in B. thuringiensis subsp. medellin Cry11Bb toxin activation.

Keywords

Bacillus thuringiensis Cry11Bb toxin Activation Gut proteases Culex quinquefasciatus

Introducción

Bacillus thuringiensis sintetiza y empaca proteínas denominadas 8-endotoxinas en una inclusión cristalina durante el estado de esporulación que son tóxicas contra diferentes órdenes de insectos (Navon 1993; Becker y Margalit 1993; Keller y Langenbruch 1993). Después de la ingestión por parte del insecto susceptible, el cristal es solubilizado bajo las condiciones reductoras y alcalinas del intestino medio y procesada a fragmentos más pequeños mediante la participación de las proteasas intestinales (Tojo y Aizawa 1983; Rajamohan et al. 1998; Dai y Gill 1993). Los polipeptidos resultantes reconocen receptores específicos sobre la superficie intestinal, los cuales catalizan la inserción de la toxina en la membrana celular llevando a la formación de canales iónicos y a la muerte del insecto por desbalance osmótico (Rajamohan et al. 1998).

La incubación de las toxinas Cry4Aa y Cry4Ba de B. thuringiensis subesp. israelensis con extractos intestinales resulta en la formación de fragmentos de aproximadamente 46-48 kDa (Angsuthanasombat et al 1992). De la misma manera, la toxina Cry 11Aa de la misma especie, es procesada in vitro e in vivo a fragmentos de 30-40 kDa por proteasas del mosquito Culex quinquefasciatus (Dai y Gill 1993). Esto indica que el procesamiento es un paso necesario en la activación de estas toxinas bacterianas (Rajamohan et al. 1998).

Bacillus thuringiensis subesp. medellin fue señalada por Orduz et al. en 1992. Las proteínas que componen su inclusión cristalina han sido denominadas Cry11Bb (Orduz. et al. 1998), CytlAbl (Thiéry et al. 1997), y una proteína de 68 kDa (Orduz et al. 1994). La proteína Cryl1Bb muestra actividad tóxica frente a diferentes especies de larvas de mosquitos y su toxicidad es mayor que la toxicidad producida por la proteína CryllAa de Bacillus thuringiensis subesp. israelensis (Restrepo et al. 1997; Orduz et al. 1998). En este trabajo estudiamos la activación proteolítica de la toxina Cry 11Bb de Bacillus thuringiensis subesp. medellin por extractos intestinales de larvas de C. quinquefasciatus y tripsina; se comprobó el efecto del pH sobre la proteólisis de la toxina, así como su cinética; se identificaron los sitios de corte mediante la secuencia amino terminal de los fragmentos generados y se determinó la toxicidad de la forma activada comparada con la toxina cristalina.

Materiales y Métodos

Toxina, anticuerpos y mosquitos. La toxina Cryl1Bb de Bacillus thuringiensis subsp. medellin se obtuvo de una bacteria recombinante B. thuringiensis cepa 4Q2-81 transformada con el plásmido pBTM3 que contiene un fragmento de ADN de 4.4 kb que codifica para la proteína (Restrepo et al. 1997). Los mosquitos de la especie C. quinquefasciatus fueron mantenidos bajo condiciones de laboratorio a 30±2°C con un fotoperíodo luz-oscuridad de 12:12 h. Los anticuerpos anti-Cry11Bb fueron producidos en ratón (Orduz et al. 1996).

Preparación y solubilización de la toxina de 94 kDa. La toxina fue aislada de las bacterias esporuladas de acuerdo con el método de Otieno-Ayayo et al. (1993): un cultivo completo final (250 ml) se lavó dos veces con agua destilada, el botón resultante se resuspendió en NaCl 50 mM por 1 h a 30°C y se lavó dos veces con agua destilada. El botón se resuspendió en agua y se adicionó a una mezcla de volúmenes iguales de Na₂SO₄al 1% y CCl₄. La mezcla se agitó vigorosamente por 10 min en un embudo de decantación y reposó por 1 h hasta la formación de dos fases. La fase superior con los cristales se lavó dos veces con agua destilada y se almacenó a -20°C. Los cristales se solubilizaron en una solución tampón Caps 100 mM, ß-mercaptoethanol al 0.05%m, pH 10.6 por 1 h a 30°C, el material insoluble se removió por centrifugación a 12.000 rpm por 10 min (Choma et al. 1990). La concentración de la proteína soluble se determinó por el método de Bradford usando albúmina bovina sérica (ABS) como estándar.

Preparación de las proteasas intestinales. Las proteasas intestinales se prepararon a partir de larvas de tercer ínstar de C. quinquefasciatus de acuerdo con Garczynski et al. (1991). Larvas de cuarto instar se lavaron con agua destilada y se pusieron en hielo durante 15 min. Los intestinos se disecaron, se colocaron en tampón de maceración, (mannitol 0.3 M, tris-HCI 0.1 M, pH 7.2) y se almacenaron a -70°C hasta su uso. El tejido se maceró mecánicamente en el mismo tampón suplementado con fenil-metil-sulfonil-fluoruro 0.1 M (PMSF). El macerado se clarificó a 12.000 rpm por 30 min, la suspensión se pasó a través de un filtro de 0.2 µm y se almacenó a -70°C. La concentración de proteína soluble se determinó como ya se mencionó.

Activación in vitro. La actividad proteolítica de los extractos intestinales se realizó empleando la toxina como substrato de acuerdo con Choma et al. (1990). Se incubaron 100 µg de la toxina en dos relaciones toxina: proteasas (peso:peso) de 100:1 y 5:1, en presencia de CaCI₂ 1 mM a 25°C. La reacción se detuvo a diferentes tiempos (1,2, 5, 10, 30, 60, 120 min y 20 h) mediante la adición de 10 ul de buffer de carga suplementado con PMSF 10 mM y ácido etil-endiamino tetra-acético (EDTA) 20 mM. Los productos de la proteólisis se analizaron mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida al 10% (SDS-PAGE). Los fragmentos se visualizaron mediante tinción con azul de Coomasie y el peso molecular se determinó mediante el análisis de los geles con el programa NIH image (versión 1.56). El mismo procedimiento se aplicó para analizar el efecto del pH en la activación, los pHs fueron: pH 7.1 y 7.7 en Na₂HPO₄-KH₂PO₄ 50 mM; pH 8.0 y 8.8 en Tris-HCI50 mM; pH 9.0, 9.5 y 9.9 en NaHCO₃-Na₂CO₃ 50 mM y pH 10.6 en Caps 100 mM, ß-mercaptoetanol al 0.05%.

Secuencia N-terminal de los fragmentos de 30 y 33 kDa. La toxina Cry 11Bb se trató como se describió en activación in vitro y los fragmentos se prepararon para la secuencia N-terminal de acuerdo con las técnicas de Reim y Speicher (1997). Las bandas individuales se cortaron y se aplicaron a la columna de un secuenciador automático Applied Biosystems modelo 477A. El análisis de los derivados aminoácido-feniltiohidantoina se hizo con un sistema HPLC Applied Biosystems modelo 120A conectado al secuenciador.

Activación in vivo. Se realizó de acuerdo con Dai y Gill (1993): cinco larvas de cuarto ínstar de C. quinquefasciatus se suspendieron en 1 ml de agua destilada que contenía 10 µg del cristal de la toxina Cry11Bb por espacio de 1 h, entonces se lavaron con 100 ml de agua destilada a través de un cedazo de 0.75 µm, el intestino fue extraído y resuspendido en buffer de carga a 95°C. Los fragmentos se separaron por SDS-PAGE y transfirieron a una membrana de nitrocelulosa de acuerdo con Reim y Speicher (1997). La membrana fue evaluada con un anticuerpo policlonal anti-Cry11Bb. Se empleó un anticuerpo secundario anti-ratón IgG producido en cobayo acoplado a fosfatasa alcalina y como substrato cromogénico se empleó cloruro de nitrotatrazolium azul (1 mg/ml) y 5-bromo-4cloro-3-indolil fosfato (1.5 mg/ml en dimetil-formamida).

Bioensayos. La toxicidad de los fragmentos proteolíticos de la toxina Cry 111Bb se determinó por medio de bioensayos en larvas de primer instar de mosquitos (Orduz et al. 1996). La toxina solubilizada (100 µg) se incubó con las proteasas intestinales y tripsina (10 µg) en Caps 100 mM; ß-mercaptoethanol al 0.05% de pH 10.6 por 16 h a 25°C. El digerido se adicionó a 1 ml de agua destilada que contenía 5 larvas de primer instar de C. quinquefasciatus. La mortalidad fue leída a las 24 h y la concentración letal media LC₅₀ se estimó mediante el análisis probit (Raymond 1985).

Resultados

Efecto del pH sobre la activación de la toxina Cry11Bb. La tripsina y las proteasas intestinales digirieron la toxina Cry11Bb en fragmentos principales de 30 y 33 kDa en los pHs entre 7.0 y 10.6 (Fig. 1). La activación de la inclusión cristalina fue parcial a los pHs neutro y alcalino, sinembargo, fue completa al pH de 10.6. El cristal muestra la formación de fragmentos de masas moleculares intermedias entre 97 y 68 kDa y la dupla de 30 y 33 kDa (Fig. 1A y 1B). En contraste, la activación de la toxina soluble mostró la formación de diferentes polipeptidos de peso molecular entre 45 y 30 kDa (Fig. 1 C y 1D). Adicionalmente, la tripsina clivó la toxina soluble en al menos cuatro polipeptidos de aproximadamente 70-68 kDa (Fig. 1C). Este estudio mostró la formación de intermediarios entre la proteína Cry11Bb y los fragmentos de 30 y 33 kDa (Fig. 1A y 1B).

Figura 1.

Efecto del pH sobre la activación de la toxina Cry11Bb de Bacillus thuringiensis subesp. medellin. A, cristales activados con tripsina; B, cristales activados con proteasas intestinales de Culex quinquefasciatus; C, toxina soluble activada con tripsina y D, toxina soluble activada con proteasas intestinales de Culex quinquefasciatus. Carril 1, marcador de peso molecular; carril 2, toxina Cry11Bb; carril 3, pH 7.1; carril 4, pH 7.7; carril 5, pH 8.0; carril 6, pH 8.8; carril 7, pH 9.0; carril 8, pH 9.5; carril 9, pH 9.9 y carril 10, pH 10.6.

Activación in vitro de la toxina Cry11Bb. El estudio de la activación a los diferentes tiempos de incubación evidenció que la formación de los fragmentos de 30 y 33 kDa ocurre rápidamente (Fig. 2); además, ésta fue dependiente de la proporción toxina: proteasa. Los fragmentos proteolíticos de 30 y 33 kDa aparecieron después de 10 min en la proporción toxina: proteasa de 5:1 y a los 30 min en la proporción de 100:1 (Fig. 2A y 2B). Para determinar el tipo de actividad proteolítica presente en los extractos, se estudió la proteólisis de la toxina con tripsina. Esta generó fragmentos básicamente iguales a los generados por las proteasas intestinales (Fig. 1A y IC).

Figura 2.

Activación in vitro de la toxina Cry11Bb de Bacillus thuringiensis subesp. medellin por las proteasas intestinales de C. quinquefasciatus a diferentes intervalos de tiempo. Panel A, proporción toxina: proteasa de 100:1; panel B, proporción toxina: proteasa de 5:1. Carril 1, marcadores de peso molecular; carril 2, Toxina Cry11Bb; carril 3, 1 min; carril 4, 2 min; carril 5, 5 min; carril 6, 10 mina; carril 7, 30 min; carril 8, 60 min; carril 9, 120 min; carril 10, 20 h.

Secuencia N-terminal de 30 y 33 kDa. Veinte residuos desde el extremo N-terminal se leyeron de cada fragmento, las secuencias obtenidas se compararon con la secuencia completa de la toxina Cry11Bb (Orduz et al. 1998). La secuencia del fragmento de 33 kDa generado por las proteasas intestinales y la tripsina fue estimada como ³⁹⁶NTRNEILTHTVPITHHPPD⁴¹⁴, mientras que la secuencia del fragmento de 30 kDa se determinó como ⁶⁰IAPALIAVAPIAKYLATALA⁷⁹ cuando fue procesada por las proteasas intestinales e ⁵⁶IEPSIAPALIAVAPIAKYLA⁷⁵ cuando fue procesada con tripsina. Un corrimiento de 4 aminoácidos se observó en la secuencia de este fragmento (Tabla 1).

Activación in vivo de la inclusión de la proteína Cry11Bb. Después de 30 min de ingerida la toxina por las larvas de tercer instar de C. quinquefasciatus se observó la presencia de fragmentos de 27, 30 y 33 kDa (Fig. 3A). De la misma manera, un experimento paralelo in vitro mostró la formación de los mismos fragmentos. El fragmento de 27 kDa fue revelado cuando los productos de activación fueron analizados por medio de la técnica de western blot. Se observó mortalidad en las larvas expuestas a la toxina y en algunos casos una pérdida de vitalidad en las larvas. No se detectó actividad proteolítica posterior a 1 h de incubación (Fig. 3B).

Toxicidad de la toxina Cry11Bb activada. La toxicidad de la toxina activada se comparó con la toxicidad de la inclusión y la toxina soluble. El valor del LC₅₀ de la inclusión parasporal de la toxina Cry11Bb hacia larvas de primer ínstar fue calculado en 22.12 ng/ml. Mientras que el LC₅₀ de la toxina soluble fue 114.47 ng/ml como consecuencia de la solubilización; esto indica una reducción en un factor de cinco en la potencia de la toxina. Sin embargo, cuando la toxina fue activada con los extractos intestinales de C. quinquefasciatus y tripsina, mostró un LC₅₀ de 38.25 ng/ml y de 28.27 ng/ml respectivamente, valores éstos, que son próximos a los valores de toxicidad reportados para la inclusión en la tabla 2.

Figura 3.

Activación in vivo de la toxina Cry 11Bb de Bacillus thuringiensis subesp. medellin por larvas de tercer ínstar de Culex quinquefasciatus. A, activación in vivo; B, activación in vitro. Carril 1, 10 min: carril 2, 30 min; carril 3, 60 min; carril 4, 120 min y carril 5. 20 h.

Tabla 1.

Secuencia N-terminal de los fragmentos generados por la activación de la toxina Cry11Bb de Bacillus thuringiensis subesp. medellin por tripsina y extractos intestinales de Culex quinquefasciatus

Fragmentos	Secuencia N-terminal	Sitio de corte	Tipo de proteasa
33 kDa	³⁹⁶NTRNEILTHTVPITHHPPD⁴¹⁴	A³⁹⁵-N³⁹⁶	Tripsina
30 kDa	⁵⁶IEPSIAPALIAVAPIAKYLA⁷⁵	K⁵⁵-I⁵⁶	Tripsina
Extracto intestinal Culex quinquefasciatus
33 kDa	³⁹⁶NTRNEILTHTVPITHHPPD⁴¹⁴	A³⁹⁵-N³⁹⁶	Tripsina
30 kDa	⁶⁰IAPALIAVAPIAKYLATALA⁷⁹	S⁵⁹-I⁶⁰	ND

Los números indican la posición de los aminoácidos en la secuencia completa de la proteína (Orduz et al. 1998). Las secuencias están indicadas en código de una sola letra. ND, No determinado.

Tabla 2.

Toxicidad de la proteína Cry11Bb activada con tripsina y extractos intestinales de Culex quinquefasciatus frente al cristal y la toxina soluble

Proteína	LC₅₀ (ng/ml)
Toxina Cry11Bb (inclusión cristalina)	22.12 (16.77-29.76)*
Toxina Cry11Bb (solubilizada)	114.47 (59.59-295.87)
Toxina Cry11Bb activada con:
Extractos intestinales de Culex quinquefasciatus	38.25 (29.04-50.34)
Tripsina	28.27 (19.45-41.67)

Intervalos de confianza del 95%.

Discusión

La solubilización y modificaciones bioquímicas ulteriores que sufren las proteínas tóxicas de B. thuringiensis desde una forma inactiva hasta una forma activa, son pasos obligados en el proceso que conduce a la toxicidad hacia larvas de insectos (Andrews et al. 1985; Nicolás et al. 1990; Aronson et al. 1991; Dai y Gill 1993). En este estudio se observó que la toxina Cry11Bb fue rápidamente procesada in vitro e in vivo a fragmentos de 30 and 33 kDa por la tripsina y los extractos intestinales.

Se encontró que la mayor proteólisis de la toxina CryllBb de B. thuringiensis subesp, medellin se llevó a cabo a los valores de pH alcalinos, indicando que la solubilización es importante en el procesamiento de la toxina, lo cual está de acuerdo con las condiciones fisicoquímicas del intestino medio de las larvas que se han descrito en la literatura (Dadd 1975; Berenbaum 1980).

El análisis de la tasa de procesamiento in vitro de la toxina Cry11Bb mostró que ésta transcurre rápido y a través de la formación de intermediarios entre la protoxina (Cry11Bb) y los fragmentos de 30 y 33 kDa (Fig. 1A, 1B, 1C y 1D), finalizando con la formación de dos bandas principales de 30 y 33 kDa (Fig. 2A y 2B). La activación de la toxina Cry 11Bb muestra similitudes con la activación de la toxina Cry 11Aa de B. thuringiensis (Dai y Gill 1993) y con el procesamiento de otras toxinas activas para los órdenes lepidoptera y coleoptera (Carroll et al. 1989; Andrews et al. 1985) como son: la formación de fragmentos menores que 40 kDa; un procesamiento secuencial a través de la formación de intermediarios, la ubicación de los sitios de corte situados al comienzo y en el centro de la proteína y un procesamiento de los extremos N- y C-terminal.

A diferencia de las toxinas de la familia Cry 1 presentes en varias cepas de B. thuringiensis que cuando son procesadas pierden un fragmento estructural resultando en la liberación de un polipeptido entre 60-70 kDa que corresponde al fragmento activo o toxina (Hodgman y Ellar 1990; Angsuthanasombat et al. 1992) el procesamiento de la toxina Cry11Aa de B. thuringiensis subesp. israelensis produce fragmentos de peso molecular entre 30 y 40 kDa (Dai y Gill 1993) lo cual sugiere una organización diferente en términos de estructura-función.

La proteína Cry11Bb tiene una identidad del 60.9% con Cry 11 Aa de Bacillus thuringiensis subesp. israelensis y del 83% con la proteína CryllBa de Bacillus thuringiensis subesp. jegathesan; además comparten el mismo espectro de actividad tóxica específica contra mosquitos (Orduz et al. 1998 y Restrepo et al. 1997). Los resultados de procesamiento de la toxina Cry11Bb en fragmentos de 30 y 33 kDa muestran similitud con el procesamiento observado en la toxina Cry 11Aa, lo cual es un argumento más a favor de su inclusión en ese grupo.

El procesamiento in vivo de la toxina es comparable al procesamiento in vitro, sin embargo, se observó un fragmento de 27 kDa adicional a los de 30-33 kDa. Varias hipótesis pueden explicar este resultado: (i) la participación de otras proteasas diferentes, a la tripsina en el intestino de la larva; (ii) la mayor eficiencia del procesamiento in vivo; (iii) la sensibilidad del anticuerpo empleado en la identificación de los fragmentos. La estructura primaria de la toxina Cry11Bb (Orduz et al. 1998) reveló sitios potenciales de corte para tripsina, quimotripsina, amilasa, proteinasa K, entre otros. En particular, actividad proteolítica de tripsina fue identificada en los extractos intestinales; de la misma manera, resultados no mostrados indican también que la quimotripsina procesa la proteína de manera similar a la tripsina. La presencia de tripsina y quimotripsina en el intestino de las larvas ya ha sido indicada (Yang y Davis 1971).

Los sitios de corte se ubicaron entre los aminoácidos Ser⁵⁵-Ile⁵⁶ y Ala³⁹⁵-Asn³⁹⁶, indicando que los extremos N- y C-terminal no tienen ninguna actividad mosquitocida. La predicción de la estructura secundaria de la proteína muestra que los sitios identificados se ubican en regiones que corresponden a vueltas reversas y que podrían estar en sitios expuestos de la proteína. La diferencia de 4 aminoácidos en el sitio de corte del fragmento de 30 kDa procesada con tripsina y extractos intestinales de C. quinquefasciatus (Tabla 1), indica que la región N-terminal de la proteína puede ser más susceptible al ataque de las proteasas. De la misma manera, y teniendo en cuenta la ubicación de los sitios de corte y la movilidad relativa de los fragmentos en SDS-PAGE, se puede deducir que en la activación de la proteína Cry 11Bb tiene lugar un procesamiento N- y C-terminal que lleva a la pérdida de cinco secuencias repetitivas de 16 aminoácidos de la porción C-terminal.

Los bioensayos mostraron que la solubilización y la activación proteolítica de la toxina afectan la toxicidad. Los cálculos de la toxicidad muestran una reducción en un factor de cinco cuando la toxina es solubilizada comparada con la toxicidad de la inclusión cristalina. Esta reducción en la potencia de la toxina puede ser debida a que el aparato bucal de las larvas de mosquitos está especializado en la ingestión de material particulado (Dadd 1975). Cuando la toxina se activó con tripsina y/o extractos intestinales de C. quinquefasciatus se produjo un aumento en la toxicidad en un factor de 5 comparable al factor perdido en la solubilización, así la activación restauró la actividad tóxica de la toxina; esta observación sugiere también que la activación proteolítica es un evento importante en la toxicidad de la proteína. La activación de la toxina Cry11Bb sugiere un modo de acción complejo en el cual los fragmentos N y C-terminal son indispensables para la toxicidad como ya ha sido indicado para otras toxinas como la Cry 11Aa (Dai y Gill 1993).

Conclusiones

En este trabajo se estudió la proteólisis de la toxina Cry11Bb. Se describe el procesamiento in vitro e in vivo de la toxina Cry11Bb y se concluye:

•

La toxina Cry 11Bb es realmente procesada in vitro por las proteasas intestinales larvales de la especie C. quinquefasciatus a fragmentos de 30-33 kDa.

•

Proteasas con especificidad de tripsina se detectaron en los intestinos de las larvas de C. quinquefasciatus como fue determinado mediante análisis de secuencia N-terminal.

•

Los fragmentos proteolíticos mostraron actividad tóxica frente a larvas de mosquitos, lo que sugiere que las proteasas intestinales tienen un papel en la activación de la toxina Cry11Bb.

Footnotes

Agradecimientos

Los autores de este trabajo agradecen la excelente asistencia técnica de Elizabeth Escobar. Este trabajo fue financiado por Colciencias y la Corporación para Investigaciones Biológicas.

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Abstract

Keywords

Introducción

Materiales y Métodos

Resultados

Discusión

Conclusiones

Footnotes

Agradecimientos

References