Abstract
The combined use of chemical and biological insecticides presents a promising and rational alternative to control insect pests of agricultural and medical importance. The compatibilities of the Inra297, Cenicafé.Bb9205 and UdeA13 strains of the fungus B. bassiana with the insecticide Starycide S.C. 480 Bayer R (triflumuron), a chitin synthesis inhibitor in insects, were evaluated. Combinations of three concentrations of each strain of B. bassiana (3 x 105, 1x107 and 3x108 conidia/ml) and triflumuron (0.05; 0.025 and 0.0125 μg/μl) were tested. The fungus suspension was used as a control. The compatibility of the two agents was evaluated based on conidial germination in a solid medium (Sabouraud dextrose agar) and mycelial growth in a liquid medium. Conidial germination was observed at 24 and 48 h and mycelial growth at 7 days. The germinated and non-germinated conidia and dry mycelium weight were the variables used in statistical analysis. The presence of triflumuron inhibited neither conidial germination nor mycelial growth of B. bassiana, demonstrating the compatibility. However, both conidial germination and mycelial growth in the presence of triflumuron varied among the three fungal strains that were evaluated.
Introducción
El hongo entomopatógeno, Beauveria bassiana (Bals.) Vuill, es uno de los más promisorios en control biológico de cier- tos grupos de insectos de importancia en la salud humana y en la economía agríco la. Uno de los aspectos importantes de su efectividad en el control de insectos plaga es la posibilidad de su integración con agentes químicos, maximizando su poten cial y disminuyendo el impacto ambiental que el control químico como tal pueda oca sionar (Ramarajah et al. 1967; Rivera 1993).
Müller (1965) realizó estudios en el este de Europa donde probó el sinergismo en tre B. bassiana e insecticidas con resulta dos no muy claros. Fargues (1973) probó combinaciones de B. bassiana con DDT y no encontró una predisposición significa tiva de la larva del coleóptero de la papa de Colorado, Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae) a la mi cosis por el hongo. Igualmente, Telenga et al. (1968) y Goral y Lappa (1974) usa ron combinaciones del hongo e insectici das en el control de dicho insecto. Fargues (1975) utilizó la combinación de insectici das azinphos-ethyl y carbaryl y B. bassiana encontrando que la combinación no fue tan efectiva como utilizando el químico solo. Estudios realizados por Ramarajah et al. (1967), Cadatal y Gabriel (1970), Olmert y Kenneth (1974), Gardner et al. (1979), Clark et al. (1982), Anderson y Roberts (1983) y Aguda et al. (1984) han indicado que los insecticidas pueden inhi bir el crecimiento de B. bassiana. Anderson et al. (1989) probó B. bassiana en combi nación con carbaryl. fenvalerate, anamectin, triflumuron y thuringiensen encontrando compatibilidad de estos químicos con el hongo. Por otra parte, Rivera et al. (1994) probaron el efecto de los insecticidas endo sulfan, clorpirifos, fenitrotion, diazinon PM, diazinon EM, malation, isazofos y pirimifos metil sobre el hongo entomopatógeno B. bassiana en el manejo de la broca, Hypo thenemus hampei (Ferrari), demostrando el efecto fungistático de los insecticidas sobre el aislamiento, el cual aumenta con el tiempo.
Ibarra y Varela (2002) evaluaron la compa- tibilidad de varios aislados de hongos biocontroladores entre ellos Beauveria bassiana con plaguicidas de uso común en la práctica agrícola como carbofurán y malatión como insecticidas, benomil (Benlate) y bis, ditiocarbamato de zinc (Manzate) como fungicidas; encontrando en general que los aislados presentaron una inhibición mayor con los insecticidas (en ambas concentraciones) que con los fungicidas. Con respecto a los plaguicidas, benomil inhibió considerablemente a to- dos los aislados. Los insecticidas reduje- ron ligeramente todos los aislados.
El triflumuron, (benzoylphenylurea) es un inhibidor de la síntesis de quitina e insec- ticida altamente selectivo, que interfiere en la formación de la quitina al no dejar incorporar el N-acetil-D-1-glucosamina en la ruta metabólica. Es una sustancia quí- mica de toxicidad baja para organismos acuáticos, aves y mamíferos, además, es un producto exclusivamente larvicida (Colwell y Schaeffer 1981; Howard y Wall 1995; Ortiz 1995).
El objetivo de este trabajo fue evaluar en laboratorio la germinación, desarrollo y crecimiento de B. bassiana en presencia de triflumuron, un inhibidor de la síntesis de quitina de insectos. De esta forma, se planteó como hipótesis observar efectiva- mente la compatibilidad entre los dos pro- ductos, y obtener una germinación, crecimiento y desarrollo del hongo entomopatógeno normal o mejor que si el hongo estuviera sólo.
Materiales y Métodos
Hongo entomopatógeno
Las cepas del hongo entomopatógeno Beauveria bassiana utilizadas en este estudio fueron: INRA 297, donada por el Instituto Nacional de Investigaciones Agronómicas de Francia, la cual se aisló de un heteróp- tero en Polonia; la cepa UdeA13 aislada de Rhodnius pallescens Barber (Hemiptera: Reduviidae) capturado en la región de San Onofre (Sucre), Colombia y la cepa Bb9205 donada por Cenicafé, aislada de Diatraea saccharalis (Fabricius) (Lepidoptera: Pyralidae). Estas cepas se mantuvieron en Agar Sabouraud dextrosa (Oxoid Ltd, Basinastoke, Hampshire) a 25°C durante 10 días para producir los conidios. Los conidios se cosecharon utilizando una ba- rra de vidrio y una solución acuosa estéril de 0,5% de Tween 80 como diluyente para dispersar y mantener su uniformidad. To- das las suspensiones se diluyeron en agua destilada estéril, se homogenizaron en un vortex Heidolph Reax control a 2.500 rpm (Germany 09441/707-124) y se contaron en la cámara de Neubauer. Se selecciona- ron concentraciones de 3x108, 1x107 y 3x105 conidios/ml con base en estudios previos realizados por Romaña (1992) y Arroyave (1995), quienes mostraron la ca- pacidad infectiva alta y el efecto letal en breve tiempo de dichas concentraciones sobre los insectos triatominos.
Insecticida
El insecticida utilizado fue Starycide® S.C. 480 Bayer (triflumuron): 2 cloro-N-[[[4-(trifluoro- metoxy)phenyl] aminoCarbonyl] benzamide (C.A), conocido comunmente como SIR 8514, sintetizado en Alemania por el depar- tamento de investigación química de la Bayer en 1975. En Medellín el producto fue obte- nido de la comercializadora IVANAGRO. Co- mercialmente triflumuron se presenta como una suspensión concentrada: 480 g/l. A par- tir de esta concentración inicial se prepara- ron concentraciones de 0,05; 0,025 y 0,0125 µg/µl, las cuales se eligieron para el ensayo con base en los estudios previos rea- lizados por Vásquez et al. (2002). Bayer re- comienda para el control de insectos o larvas de insectos utilizar de Starycide o triflumuron 100 ml en 100 litros de agua, con el cual se pueden fumigar alrededor de 20 casas (Pflanzenschutz 1980).
Bioensayos
Se utilizó la técnica de Storey y Gadner (1986) y Clark et al. (1982) modificada, la cual consistió en distribuir el medio líqui- do completo en 4 frascos, cada uno con 15 ml del medio. Se inocularon con 0,1 ml de las concentraciones 3x108, 1x107 y 3x105 conidios/ml de cada una de las ce- pas INRA 297, Bb9205 y UdeA13 y con cada una de las dosis de triflumuron (0,05; 0,025 y 0,0125 µg/µl). Se realizaron cua- tro repeticiones para cada tratamiento en las tres concentraciones. A los controles sólo se les adicionó el hongo en las tres concentraciones. Los frascos se agitaron a 1.500 rpm en (ORS200 Boekel Grant) du- rante siete días a 25-26°C. Después de la agitación, el contenido de cada frasco se filtró al vacío obteniendo el micelio com- pleto mediante una barra de vidrio y se lavó consecutivamente con agua destilada estéril, filtrándolo con una membrana de nitrocelulosa de 0,2 µm. Lo obtenido se secó en un horno (Memmert GmbH Co. KG8540 Germany) durante una h a 50°C y luego se pesó el micelio utilizando una balanza analítica Chyo JK-180, obtenien- do finalmente un peso promedio, (a partir de las cuatro repeticiones realizadas) que se utilizó para el análisis de los resultados.
Porcentaje de germinación de B. bassiana con triflumuron a las 24 h. Interacción dosis de triflumuron, concentración y cepas de B. bassiana. d0. Controles, d1. 0,0125 μg/μl, d2. 0,0250 μg/µl, d3. 0,050 µg/µl (dosis triflumuron). Concentraciones B. basssiana: a. 3x108, b. 1x107, y c. 3x105 conidios/ml.
Análisis estadístico
La compatibilidad del insecticida triflumu- ron con B. bassiana se midió mediante el porcentaje de germinación de conidios a las 24 y 48 h. Los porcentajes se compara- ron utilizando análisis de varianza multifac- torial, considerando como factores de evaluación la cepa del hongo, la concentra- ción de conidios y la dosis del insecticida. La compatibilidad también se analizó me- diante el crecimiento micelial del hongo en medio de cultivo líquido, obteniendo como respuesta el peso seco en gramos de la unidad experimental. Estos datos se com- pararon, igualmente, mediante análisis de varianza multifactorial. Las comparaciones múltiples de los valores promedios se esta- blecieron con el método de Neuman-Keuls. Se consideró α = 95% como nivel de signi- ficación de las pruebas estadísticas y se uti- lizó el programa STATISTICA 98 (Statsoft Inc., Tulsa, U.S.A.) para el procesamiento de la información.
Resultados
Respuesta de germinación conidial de Beauveria bassiana en presencia de triflumuron a las 24 y 48 h en medio de cultivo sólido
El porcentaje de germinación de conidios fue diferente para los tres factores en es- tudio. El análisis de varianza mostró interacciones significativas para dichos factores (p < .001) a las 24 h. Según la figura 1, la cepa UdeA13, fue la que pre- sentó mayor porcentaje de germinación en las concentraciones 3x108 y 1x107 conidios/ml y un poco menor para 3x105 conidios/ml (95,3, 94,8 y 78,9 respectiva- mente). En cambio, la cepa INRA-297 fue la segunda en porcentaje de germinación para las concentraciones 3x108 y 3x105 conidios/ml y la de menor porcentaje para la concentración 1x107 conidios/ml. Por otra parte, todas las dosis del triflumuron (0,05; 0,025 y 0,0125 μg/µl) presentaron porcentajes de germinación inferiores a los del control que estuvieron cerca del 100%. La concentración de 3x105 coni- dios/ml en presencia de triflumuron en cualquiera de las dosis evaluadas fue la que presentó la menor germinación (Tabla 1).
Promedio del porcentaje de germinación (DE: desviación estándar) de las diferen- tes cepas de Beauveria bassiana en presencia de triflumuron a las 24 h
A las 48 h las concentraciones de B. bassiana 3x108 y 1x107 conidios/ml habían germinado el 100% para todas las cepas del hongo y dosis de triflumuron. En la menor concentración de B. bassiana (3x105 conidios/ml) la germinación fue del 100% para las cepas INRA-297 y UdeA13 y del 95,5% para la cepa Cenicafé 9205.
Crecimiento micelial de Beauveria bassiana en medio de cultivo líquido después de siete días de sembrado el inóculo
El análisis de varianza mostró significancia para la interacción dosis de triflumuron y cepas de B. bassiana (p = 0,0009). Esta interacción posiblemente se puede expli- car debido a que la cepa INRA 297 tuvo un peso promedio para el control de 0,447 g significativamente mayor que para las otras dosis de triflumuron evaluadas (Tabla 2). La prueba de comparaciones múltiples permite concluir diferencias en los pesos promedios de las cepas en el orden Cenicafé Bb9205, INRA-297 y UdeA3 con pesos promedios de 0,11; 0,32 y 0,47 g respectivamente. No hubo diferencias sig- nificativas entre concentraciones del hon- go (p = 0,74).
Crecimiento micelial en medio de cultivo líquido de las cepas de B. bassiana independiente de la concentración con las dosis de triflumuron evaluadas
DE = Desviación estándar.
Discusión
Los investigadores Fargues (1973, 1975) y Anderson et al. (1989) probaron el hongo entomopatógeno B. bassiana con diferentes insecticidas observándose compa- tibilidad entre el hongo B. bassiana y el insecticida triflumuron, resultados que concuerdan con los descritos en este tra- bajo, con una confiabilidad del 95%.
Triflumuron es recomendado por Bayer para ser utilizado en domicilios para el control de insectos bajo la dosificación de 0,48 µg/µl, concentración que viene dada para 100 litros de diluyente. Las dosis de triflumuron evaluadas en este estudio fue- ron bajas (10 veces por debajo de las reco- mendadas comercialmente) y presentaron compatibilidad con las diferentes cepas de B. basssiana, y aunque se encontraron di- ferencias significativas en las respuestas entre las diferentes concentraciones y ce- pas del hongo con las dosis de triflumuron, no hubo inhibición parcial o total en la germinación ni en el crecimiento de B. bassiana.
Los resultados de no inhibición mostra- ron que la germinación, crecimiento y desarrollo del hongo B. bassiana es direc- tamente proporcional a la dosis de triflumuron utilizada en este trabajo. En la medida que se aumentó la dosis del quí- mico la sensibilidad del hongo aumentó y por lo tanto, su germinación, crecimiento y desarrollo fueron más lentas.
Las diferencias significativas que se observaron fueron más a nivel de las con- centraciones de B. bassiana y del compor- tamiento de las diferentes cepas evaluadas, en donde se encontró que la cepa UdeA13 fue la menos sensible a la acción del triflumuron, especialmente a la concentra- ción más alta probada 3x108 conidios/ml.
Anderson et al. (1989) evaluó la compati- bilidad de triflumuron con B. bassiana don- de utilizó como parámetro de evaluación las unidades formadoras de colonia. En el presente trabajo los parámetros de eva- luación fueron diferentes, (como ya se mencionó en metodología), los resultados fueron similares a los de Anderson en cuan- to a compatibilidad de los dos productos.
El triflumuron posee unas características químicas particulares como insecticida de nueva generación (inhibidor de la síntesis de quitina en insectos), entre ellas presen- ta una toxicidad más baja que la de otros químicos como los organoclorados y carbamatos; posiblemente este hecho y la utilización de dosis bajas respecto a las ofrecidas comercialmente para el control de insectos domiciliares (larvas especial- mente) permitió que B. bassiana fuera com- patible con él en todas las concentraciones evaluadas.
Una de las orientaciones de la lucha inte- grada de insectos consiste en aplicar simultáneamente gérmenes entomopató- genos con un plaguicida. Este método combina los procedimientos químicos tra- dicionales y los procedimientos biológi- cos, técnica ampliamente experimentada en Rusia, utilizando dosis variables de in- secticidas que alteran el estado fisiológico del insecto y establecen consecuentemen- te una intoxicación que predispone a la infección por el agente entomopatógeno (Telenga et al. 1968; Ferron 1970) siem- pre y cuando exista la compatibilidad de ambos.
Los resultados obtenidos en este trabajo en medio de cultivo líquido mostraron un buen crecimiento micelial independiente de la concentración aplicada del hongo entomopatógeno, contrariamente a Clark et al. (1982) quienes probaron algunos plaguicidas como mancozeb, metiram, CGA48988 y chlorothalonil los cuales ge- neraron inhibición, total, fuerte y parcial sobre B. bassiana, respectivamente. Sin embargo, en este mismo estudio, perme- trin no inhibió el crecimiento de B. bassiana y sus curvas de crecimiento presentaron similitud con los controles. Ramarajah et al. (1967) al evaluar B. bassiana con DDT, folidol, malation, endrin y BHC, mostró una estimulación a la germinación; resultados similares a los obtenidos con triflumuron en este trabajo, en donde B. bassiana pre- sentó una mayor esporulación al compa- rarla con los controles.
Rivera (1993) evaluó la compatibilidad de B. bassiana con fungicidas (ciproconazol, hexaconazol, triadimefon, oxicloruro de cobre), insecticidas (endosulfan, fenitro- tion, pirimifos-metil, dicrotofos), en sus dosis comerciales, dosis media y 1/10 de la dosis comercial, encontrando que los fungicidas ejercieron una inhibición ma- yor sobre el crecimiento del hongo que los insecticidas. Los insecticidas a concen- traciones menores de la dosis comercial presentaron un efecto menor sobre B. bassiana, resultados similares a los obte- nidos en la evaluación con triflumuron.
De las tres cepas evaluadas, Cenicafé Bb9205, INRA-297 y UdeA13, la última mos- tró ser la más compatible con el triflumuron en todas las concentraciones probadas. Como se muestra en la tabla 1, las concentraciones alta y media de B. bassiana en cualquiera de las cepas estu- diadas, dieron una germinación alta.
Al comparar lo obtenido en la prueba de germinación conidal en medio de cultivo sólido y líquido se encontró similitud en cuanto al comportamiento de la cера UdeA13, sin embargo, en el medio de culti- vo líquido la cepa UdeA13 en presencia de la dosis de triflumuron más alta (0,05 μg/ µl) presentó mayor crecimiento micelial confirmando así la alta compatibilidad y resistencia de esta cepa al insecticida.
Después de evaluar la germinación del hongo B. bassiana a las 24 y 48 h bajo la acción del triflumuron se observó que éste tiene un efecto fungistático más que fungicida, pues presentó germinación conidial y crecimiento micelial hasta las 48 h.
La humedad y la temperatura jugaron un papel primordial en la germinación y esporulación del hongo, debido a que los hongos entomopatógenos y en general los hongos requieren de temperaturas que oscilan entre 25-30°C y humedades relati- vas del 80% (Tanada y Kaya 1993). Posi- blemente pruebas en campo variarían los resultados no sólo por la fluctuación de las condiciones ambientales, sino por otros factores tales como la formulación del hon- go, y la técnica de aplicación utilizada. Es- tudios en campo seguramente aportarán resultados variables e interesantes que ayudarán a tener mayor información sobre la germinación, crecimiento y desarrollo del hongo en presencia de un químico como triflumuron.
Conclusiones
Las cepas del hongo entomopatógeno B. bassiana presentaron compatibilidad con triflumuron (insecticida regulador de crecimiento de insectos) a dosis bajas, lo cual podría considerarse como un elemen- to más, en la alternativa que ofrece el con- trol integrado en el manejo de vectores transmisores de enfermedades.
En los tratamientos de B. bassiana las cepas UdeA3 e Inra-297 con triflumuron mostraron una germinación alta y por con- siguiente resistencia al insecticida.
De las tres cepas evaluadas, UdeA13 fue menos sensible al efecto de triflumuron sobre su germinación, crecimiento y desarrollo.
En la evaluación de la compatibilidad de triflumuron con B. bassiana, en medio de cultivo líquido, no se encontraron diferen- cias importantes con respecto a la germinación conidial en medio de cultivo sólido; sin embargo, fue más práctica la prueba en medio de cultivo sólido que en medio de cultivo líquido.
Footnotes
Agradecimientos
Los autores agradecen a los profesores Jaime Calle, Abel Díaz del Instituto de Bio- logía de la Universidad de Antioquia por el aporte de material biológico, y el análisis estadístico de los resultados respectiva- mente. A los biólogos del Grupo de Inves- tigación en Micología y Control biológico del Instituto de Biología de la Universidad de Antioquia que contribuyeron en la eje- cución del proyecto. Al CODI de la Univer- sidad de Antioquia, a la Corporación de Patologías Tropicales, a la Facultad de Cien- cias Exactas y Naturales y al Instituto de Biología, por la financiación y el apoyo en la ejecución de esta investigación.