Abstract
The efficiency of biological agents depends on their knowledge, their biology, the environment and the mechanism of interaction between them and the host. During this study 76 multiesporic isolates of the entomogenous Beauveria bassiana (Bb) and 19 of the fungus Metarhizium anisopliae (Ma) were characterised through the evaluation of quantitative variables such as (PPB) pathogenicity against coffee berry borer-CBB, Hypothenemus hampei (Ferrari); TL50, time in which the probed dose causes 50% of mortality of the population; (E) spore production; (TCD) diametral growth; (TE) spore size, (PG) germination rate; (PE) enzyme reaction; (TRE) starting time of enzyme reaction. In the case of Metarhizium anisopliae (Ma), the evaluated variables were PPB, PG, PE, TRE. The isolates were classified according to PCB, establishing 4 groups: Group 1, PPB <25%; Group 2, PPB between 25% & 50%; Group 3, > than 50% and < than 80%, and Group 4, >80%. For Bb, in the Group 1, were most of them registered from H. hampei, Colombia. Within the Group 4, 15 isolates from Coleoptera, 5 from Lepidoptera and 1 from Homoptera were found; seventeen of those were isolated in Colombia and 2 from other countries. For Ma, most of them belonged to Group 4, nine from Colombia (Coleoptera). Ma9220, from Australia, (Coleoptera), belonged to Group 3. The analysis of variance of the groups showed the effect of them in the variables PPB, TL50, E, TCD, PG, PE and TRE for Bb and the variables PPB y PG for Ma; the Tukey test (p=0.05) showed that the Bb and Ma groups were different in PPB. A multivariate main component analysis was carried out with a group of 17 isolates of Bb in which the following variables were evaluated (PPB, TL50, PG, PE, TRE, E, TCD and TE). Likewise, a dendrogram (descriptive grouping) and a cluster statistic analysis were done in order to select groups of isolates according to the evaluated variables, variance analysis of the clusters (p=0,05) and Tukey test (5%) were applied to the groups of isolates. The components that more contributed to the total variation were: PE, TRE, PPB and E, in contrast, TRE, TL50, TCD and PG, accounted the lower degree of variation. The dendrogram and the cluster statistical analysis characterised three groups of isolates. However, according to the initial point of selection of the isolates, a new grouping was made, so that those isolates with PPB upper than 80% were grouped in one cluster. The analysis of variance of the groups showed differences between them in the variables PPB and TCD. The variable pathogenicity to the CBB (PPB) let the separation of groups of isolates in both type of analysis. The characterisation of the collection isolates allowed to select those variables that most contributed to the separation of isolates, to identify strains, to establish relationships between them according their biology and locality, to define their host specificity and their potential to control the CCB and other insect pests of economical importance in Colombia and other countries.
Introducción
La broca del café Hypothenemus hampei (Ferrari), (Coleoptera: Scolytidae) es el insecto plaga de mayor importancia económica en Colombia y en la mayoría de los países productores de café. Se considera oriunda de Africa Central y fue accidentalmente introducida al Brasil hacia 1913. Desde su detección en Colombia, en 1988, la Federación de Cafeteros, a través de CENICAFÉ ha promovido investigación en otras alternativas de control, usando un programa de manejo integrado. El control biológico con parasitoides y en especial, con el hongo entomopatógeno, Beauveria bassiana (Bb) constituye un medio promisorio de control, además de brindar una alternativa al uso de los plaguicidas químicos que tanto daño han causado a los ecosistemas (Cadena, 1993).
Los insectos del orden Coleoptera son conocidos por su susceptibilidad al ataque del hongo Bb; la infección puede originarse a través de dos mecanismos: el hongo puede diseminarse con el insecto a medida que éste coloniza nuevas áreas geográficas, o puede diseminarse a través de otros insectos presentes en forma local. Estas diferencias podrían ser importantes en términos del desarrollo del hongo como micoinsecticida. Es además de interés, seleccionar aquellos aislamientos de diferentes hospederos y áreas geográficas, para identificar en una forma precisa su variabilidad, con el fin de seleccionar la mejor cepa con características adaptativas que favorecen su sobrevivencia y optimizar su eficiencia como bioinsecticida contra la broca del café. Para el logro de este propósito, es necesario entender su genética, aspectos fisiológicos, factores de virulencia, etc. La identificación se realiza por morfología, características de cultivo, virulencia hacia el hospedero sobre el cual se dirige el control, análisis de isoenzimas, patrones RFLP y otros métodos como PCR. Cada uno de estos métodos tiene ventajas y aplicaciones específicas. Su confiabilidad y sensibilidad es particularmente útil para la evaluación de un gran número de muestras.
Teniendo en cuenta el gran recurso genético que representa nuestra colección de aislamientos del hongo Bb, como una alternativa biológica para el control de la broca y de otros insectos de importancia económica en Colombia y partiendo de la hipótesis en la cual se afirma que existen diferencias entre los aislamientos según su distribución geográfica y el orden insectil al que pertenecen, el objetivo primordial de este estudio fue realizar una caracterización morfológica, patogénica y enzimática de los aislamientos de la colección, con el fin de determinar aquellas variables que más contribuyen a su variación y seleccionar los mejores aislamientos a usar en programas de manejo integrado de la broca.
Materiales y Métodos
Los aislamientos usados en los diferentes experimentos se cultivaron en Sabouraud Dextrosa agar (SDA) durante 15 días a 25°C y posteriormente se activaron a través de la broca del café, según la metodología descrita por Vélez et al. 1997.
Para este propósito, suspensiones de esporas de concentración conocida de los hongos Bb y Ma (1x10⁶ con/ml) se depositaron en agua destilada estéril y se sometieron a las diferentes temperaturas mencionadas durante 30 minutos. Al cabo de este tiempo, diez alícuotas de 5 microlitros se depositaron en cajas de petri con medio SDA e incubadas a 25°C durante 24 horas. Cinco cajas de petri se usaron para cada tratamiento. La germinación del hongo fue determinada teniendo en cuenta que, al menos 25% de las esporas, presentaran un tubo germinativo equivalente a la mitad del tamaño de éstas.
Los experimentos fueron realizados de acuerdo con la metodología descrita por Vilas Boas et al. 1992. Suspensiones de esporas se prepararon en Tween 80 al 1% y se colocaron en beakers, a razón de 1 ml, para ser luego sometidos a irradiación en una lámpara de luz ultravioleta (5Joules/m2/s) de luz mineral, a 115 voltios, 50-60 amperios. Después de exposición de las suspensiones de esporas a diferentes tiempos (10, 30 y 60 minutos), se realizaron diluciones sucesivas en base diez y a partir de éstas se inocularon 0.1 ml de la suspensión diluida de esporas en el centro de cajas de petri con medio SDA. Posteriormente, este inóculo depositado fue distribuido en la superficie del medio con la ayuda de una pipeta estéril y se llevaron las cajas a incubación a 25°C durante diez días, hasta la obtención de UFC/ml o propágulos de estos hongos. La selección de los aislamientos tolerantes al efecto de la luz ultravioleta se realizó teniendo en cuenta aquellos que desarrollaron UFC/ml en el medio SDA, después de haber sido sometidos al efecto de este agente mutagénico, con respecto a testigos no irradiados.
En un enfoque inicial de análisis, los aislamientos de Bb y Ma se clasificaron según su porcentaje de patogenicidad sobre la broca del café, teniendo en cuenta que ésta es una de las variables que determina la aplicación eficiente del hongo Bb en la regulación de poblaciones de H. hampei. De esta forma, se establecieron cuatro grupos: grupo 1, conformado por aislamientos con porcentajes de patogenicidad (PPB) menores del 25%; grupo 2: PPB entre el 25 y el 50%; grupo 3: por aislamientos con porcentajes de patogenicidad (PPB) mayores del 50% y menores del 80% y grupo 4: mayores del 80%.
Resultados y Discusión
Análisis Inicial
En el análisis de varianza, para la evaluación de los grupos, se observó el efecto de éstos con las variables PPB, TL50, E, TCD, PG, PE y TRE para el hongo Bb (Tabla 2) y con las variables PPB y PG para el hongo Ma (Tabla 4); la prueba de comparación de promedios de Tukey mostró que los grupos de Bb y Ma son diferentes estadísticamente en la variable PPB (p=0.05) (Tablas 2 y 4).
Los resultados obtenidos muestran que aquellos aislamientos que presentan PPB mayores del 80% (grupo 4), presentan a su vez los mayores porcentajes de germinación (Tabla 2). El grupo 4 mostró los promedios más bajos de TL50. Cabe anotar que no se presentaron diferencias estadísticas significativas para esta variable en los grupos 3 y 4, lo cual permite inferir que PPB mayores del 50% no necesariamente corresponden a cambios en TL50, mientras que bajos PPB (< del 50%) muestran diferencias evidentes en el valor TL50 (Tabla 2).
El grupo 3 presentó los promedios mayores de PE y E y a su vez, los promedios menores de estas variables los presentó el grupo 4.
El grupo 4 de Bb estuvo conformado por 24 aislamientos, 15 de los cuales se aislaron del orden Coleoptera. De estos, 11 provienen de la familia Scolytidae, género Hypothenemus, especie hampei y fueron atacados por el hongo Bb en condiciones naturales. Tres aislamientos proceden de la familia Curculionidae y uno de la familia Scarabaeidae. Adicionalmente, este grupo estuvo conformado por cinco aislamientos del orden Lepidoptera, dos de la familia Pyralidae, uno de la familia Stenomidae, uno de la familia Geometridae y uno de la familia Cossidae. En cuanto al origen geográfico de los aislamientos de Bb, 17 son procedentes de Colombia, cinco de otros países: China, Tailandia, Ecuador e Italia. Dos son de procedencia desconocida (Tabla 1).
En los aislamientos de Bb colombianos, se destacan cuatro del departamento de Antioquia y cuatro del departamento de Risaralda, lo que permite sugerir que se trata posiblemente del mismo aislamiento, circunscrito a una determinada región geográfica. Registros previos (Posada y Vélez 1998) de temperatura, humedad relativa y altitud en la cual se encontraron dichos aislamientos, evidencian su distribución en rangos de temperatura comprendidos entre 19,2 y 22,1°C, de altitud entre 1200 y 1590 msnm y de humedad relativa entre 74 y 86%; así mismo, el mayor número de registros de estos aislamientos se encontró en el cultivo de café (Posada y Vélez 1998).
En cuanto a las características de germinación y producción enzimática de este grupo de aislamientos de Bb, circunscritos a una determinada área geográfica, cabe mencionar que se presentaron porcentajes de germinación que fluctuaron entre 75 y 92%, con valores superiores al 80% en la mayor parte de los aislamientos y el porcentaje de producción enzimática mostró promedios entre 41 y 75%, con la mayor parte de ellos comprendidos entre 50 y 60%.
En contraste, el grupo 1 de Bb estuvo conformado por ocho aislamientos, cinco de éstos provenientes del orden Coleoptera, familia Scolytidae, género Hypothenemus, especie hampei. Adicionalmente, en este grupo se presentaron registros del hongo en los órdenes Lepidoptera y Homoptera.
Con respecto a la localidad de los aislamientos de Bb de este grupo, seis de ellos son colombianos, cuatro del Departamento de Antioquia y uno de Risaralda. Dos son de localidad extranjera: Tailandia y Filipinas. Del total de aislamientos registrados en Antioquia, tres fueron aislados de H. hampei.
Los aislamientos de Bb de este grupo mostraron un valor promedio de patogenicidad de 14,09%, con un mínimo de 4,58 y un máximo de 24,58%. El valor promedio de germinación de los aislamientos fue de 70,94% y fluctuó entre 19,98 y 89,05% y el promedio de producción enzimática fue de 75% y fluctuó entre 43 y 100%. Los promedios bajos de patogenicidad, presentados en este grupo (14,09%), correspondieron a promedios de germinación de 70,94 (Tabla 2).
Registros climáticos previos (Posada y Vélez 1998) dc las localidades en las cuales se presentaron los aislamientos de este grupo, evidencian su distribución en rangos de temperatura comprendidos entre 19,2 y 21,6°C, humedad relativa entre 74 y 86% y altitud, comprendida entre 1200 y 1500 msnm. Adicionalmente, el cultivo del cual se llevó a cabo el registro de la mayor parte de éstos fue el café (Posada y Velez 1998).
En cuanto a la relación existente entre los aislamientos y el hospedero en el cual fueron registrados, podría demostrarse, según los resultados obtenidos, cierta especificadad al ataque de la broca del café por parte de los aislamientos del grupo 4, en la medida que un 60,8% de los aislamientos de este grupo provienen del orden Coleoptera, dentro de los cuales se registra en un 43% de los aislamientos cuya procedencia fue de la broca del café, H. hampei. Tal respuesta, coincide con las afirmaciones de Prior en 1992, en cuanto al mayor grado de virulencia de los aislamientos que han coevolucionado con el insecto sobre el cual se dirige el control. Sin embargo, un 62,5% de los aislamientos del grupo I fueron registrados en H. hampei y presentaron un bajo grado de virulencia a la broca del café (PPB menor del 25%). Por tal razón, los resultados obtenidos en el presente estudio no permiten inferir características de especificidad a los aislamientos evaluados.
Es posible que la respuesta de patogenicidad a la broca de los aislamientos del grupo 1 pueda explicarse según el criterio en el cual se asume que aquellos aislamientos que han coevolucionado a través de largos períodos con un hospedero determinado establecen un equilibrio con éste, de forma que puede reducirse su virulencia (Prior 1992). De esta forma, es posible que otros aislamientos procedentes de ordenes insectiles diferentes puedan ejercer una mayor acción patogénica sobre dicho hospedero (Hokkanen y Pimentel 1984; Waage 1990). Fue así como en los grupos 2 y 3, un 30,3% y 62,5% de los aislamientos, respectivamente, provenían de H. hampei y sin embargo, no mostraron el mayor grado de virulencia a la broca.
Con relación a los aislamientos de otros ordenes, que presentaron los mayores porcentajes de patogenicidad a la broca del café (grupo 4), en el presente estudio se registraron aislamientos procedentes de los ordenes Lepidoptera y Homoptera. En el orden Lepidoptera, se registraron aislamientos de las familias Cossidae, Pyralidae, Geometridae y Stenomidae y en el orden Homoptera, sólo se registró un aislamiento de la familia Delphacidae. Lo anterior, confirma la virulencia de aislamientos de estos hongos entomopatógenos, aislados de otros órdenes diferentes a aquel sobre el cual se aplica el control. De acuerdo con este criterio, se sugiere que la búsqueda de antagonistas debe hacerse también en otros ambientes diferentes a aquel en el cual se desarrolla el insecto plaga de interés (Hokkanen y Pimentel 1984; Waage 1990), porque dichos antagonistas pueden mostrar una actividad potencial de control sobre insectos de otros órdenes y ambientes diferentes y al encuentro de un nuevo hospedero, el antagonista desarrolla mecanismos más eficientes para ejercer su acción patogénica sobre éste (Prior 1992). En este proceso se llevan a cabo interacciones específicas entre los organismos, que dependen en gran parte de los componentes cuticulares del insecto objeto de control (Hajek y St. Leger 1994).
En el contexto de la patología de los insectos y específicamente para patógenos fúngicos, parece más seguro referirse a cultivos de individuos como aislamientos y ésta es la única definición válida para aislamientos que se derivan de genotipos mezclados (Prior 1992). Sin embargo, teniendo en cuenta las relaciones y diferencias existentes entre algunas de las variables en cada uno de los grupos, se sugiere la existencia de cepas, término usado por morfólogos, genetistas, ecologistas y patólogos, con diferentes implicaciones para cada caso. Una cepa se deriva de un aislamiento y debe distinguirse de otras cepas en criterios morfológicos, bioquímicos y patológicos (Prior 1992).
Con respecto a los aislamientos de Ma, los resultados mostraron que el grupo 3 presentó los promedios mayores de las variables PE y PG. El grupo 4 de Ma estuvo conformado por 18 aislamientos, de los cuales 9 provienen del orden Coleoptera. De éstos, seis pertenecen a la familia Scarabaeidae y se obtuvieron de diferentes géneros de esta familia. Un aislamiento de este orden pertenece a la familia Curculionidae y uno a la familia Scolytidae. Adicionalmente, el grupo estuvo conformado por cuatro aislamientos del orden Homoptera y uno del orden Hymenoptera (Tabla 4).
Resistencia a la luz ultravioleta y a la temperatura
La tabla 5 ilustra la respuesta de los aislamientos sometidos a diferentes temperaturas y tiempos de exposición a la luz ultravioleta.
En el caso específico de la luz ultravioleta, se presenta la respuesta de algunos aislamientos del grupo 4, a diferentes períodos de exposición a la luz ultravioleta (10, 30 y 60 minutos). Dentro del grupo de aislamientos evaluados se destacan los aislamientos Bb 9002 y Bb 9218, provenientes del orden Coleoptera, por su mayor grado de resistencia a la luz ultravioleta (60 minutos), seguido de los aislamientos Bb 9027 y Bb 9212 (30 minutos), de los órdenes Homoptera y Coleoptera, respectivamente y de los aislamientos Bb 9012, Bb 9021 y Bb 9205 (10 minutos), los dos primeros del orden Coleoptera y el último del orden Lepidoptera. Otros aislamientos evaluados no presentaron ningún grado de tolerancia al efecto de la luz ultravioleta, como fueron Bb 9204 y Bb 9301, de los órdenes Lepidoptera y Coleoptera. Cabe anotar que uno de los aislamientos más resistentes a la luz ultravioleta (Bb 9002) fue registrado atacando la broca del café, H. hampei, en el foco inicial de este insecto plaga localizado al sur del país, en el departamento de Nariño, municipio de Ancuya.
Con referencia a la temperatura, la tabla 5 ilustra aquellos aislamientos que presentaron algún grado de tolerancia a temperaturas altas y bajas. Aquellos aislamientos del hongo Bb que presentaron el mayor grado de resistencia a la luz UV, presentaron crecimiento en todas las temperaturas evaluadas (Bb 9002 y Bb 9218). Adicionalmente, Ma 9303, el cual mostró un alto grado de resistencia a la luz UV (10,30 y 60 minutos), presentó crecimiento en todas las temperaturas, excepto 55°C. Los aislamientos mencionados muestran potencial para el control de la broca del café en condiciones de campo.
Análisis multivariado
Teniendo en cuenta el conjunto de variables evaluadas en los aislamientos del hongo Bb, el análisis multivariado mostró que los componentes que más contribuyen a la variación total son en su orden: PE, TRE, PPB y E, mientras que las variables que explicaron en menor grado la variación fueron: TE, TL50, TCD y PG.
El dendrograma, caracterizó a los aislamientos en tres grupos en una forma descriptiva (Fig. 1). Al aplicar el análisis de grupo o cluster para los tres grupos, fue observado que en el grupo 1 se presentaron dos aislamientos; en el grupo 2, diez aislamientos y en el grupo 3, cinco aislamientos. Cabe destacar que el aislamiento Bb 9305 no quedó en el mismo grupo del dendrograma (Tabla 6).
Los grupos clasificados según el análisis cluster fueron sometidos a un análisis de varianza y se presentaron diferencias estadísticasativas entre éstos (p=0.05), en cada una de las variables sometidas al análisis multivariado. Al aplicar la prueba de comparación de Tukey se observó que los tres grupos diferían estadísticamente en las variables PPB, PE, E, TCD y TL50 (p=0.05) (Tabla 6).
La variable PPB utilizada como criterio de clasificación en el análisis inicial de la información, fue uno de los componentes que más contribuyó a la variación total de los aislamientos, según el análisis multivariado. Adicionalmente, esta variable permitió la separación de los diferentes clusters en las pruebas paramétricas realizadas.
Teniendo en cuenta que uno de los objetivos del estudio fue seleccionar aislamientos con PPB > del 80%, al evaluar la agrupación del análisis cluster, se observó que el cluster 2 estaba conformado por aislamientos con PPB < y > del 80%, por lo tanto, en virtud del objetivo propuesto, dichos aislamientos fueron reagrupados, de forma que aquellos con PPB entre 53 y 80% fueron asignados al cluster uno; en el cluster dos se agruparon los aislamientos con PPB > del 80% y en el cluster tres, aquellos con PPB < 53,3%.
En el análisis de varianza para la evaluación de los clusters se observó el efecto de éstos en todas las variables evaluadas (p=0.05). La prueba de Tukey separó estadísticamente los tres clusters en las variables PPB y TCD (p=0.05). Cabe anotar que el cluster dos, con el mayor promedio de PPB, presentó estadísticamente el menor promedio de E y el menor promedio de PE. Adicionalmente, este cluster presentó los menores promedios de la variable TL50, lo cual es obvio, teniendo en cuenta que a mayor PPB, menor es el tiempo requerido para causar mortalidad en el 50% de los individuos (Tabla 7).
Los promedios mayores de las variables PPB, TCD, TE y PG, se obtuvieron en los aislamientos que conformaron el cluster dos. Sin embargo, en este cluster se presentaron a su vez, los promedios menores de las variables TL50 E y PE. La respuesta de las variables PPB y PE no está de acuerdo con registros en los cuales se asocia la actividad enzimática de estos hongos con su grado de virulencia hacia el insecto sobre el cual se dirige el control (St Leger et al. 1988; Bidochka y Kachatourians 1990). Trabajos previos han demostrado que no existe una asociación clara entre las variables PPB y E (Narváez 1996) (Tabla 7). El cluster tres presentó los menores promedios de las variables PPB y TCD (Tabla 7), sin embargo, en este cluster se registraron los promedios mayores de las variables TL50, E y PE.
Conclusiones
La caracterización de la colección de aislamientos permitió:
Seleccionar aquellas variables que contribuyeron en mayor y menor grado a la separación de grupos de aislamientos.
Identificar cepas, es decir, aislamientos caracterizados según criterios morfológicos, enzimáticos y patogénicos.
Establecer relaciones entre cepas de acuerdo a su biología y localidad y definir especificidad de hospederos.
Seleccionar con propósitos de formulación comercial aquellas cepas que presentan algún grado de tolerancia al efecto de la luz ultravioleta y al crecimiento en rangos altos y bajos de temperatura y por último, determinar el potencial de las cepas para el control de la broca del café dentro de un esquema de manejo integrado.
Agradecimientos
La realización de este estudio fue posible gracias al soporte financiero brindado por el Instituto Colombiano de Ciencia y Tecnología, Colciencias y la Federación Nacional de Cafeteros de Colombia, a través de su centro de investigación, Cenicafé, dentro del marco del proyecto "Caracterización y obtención de cepas mejoradas de hongos entomo-patógenos para el control de la broca del café".
Grupos de aislamientos clasificados en forma descriptiva en el dendrograma
Relación de aislamientos del hongo Beauveria bassiana, hospedero, localidad y promedio de las variables evaluadas
Promodio, variación, valoros mínimos y máximos de las variables evaluadas en los diferentes grupos de aislamientos del hongo Beauveria bassiana.
Relación de aislamientos del hongo Metarhizium anisopliae, hospedero, localidad y promedio de las variables evaluadas
Promedio, variación, valores mínimos y máximos de las variables evaluadas en los diferentes grupos de aislamientos del hongo Metarhizium anisopliae.
Aislamientos de los hongos B. bassiana y M. anisopliae evaluados por resistencia a la luz UV y crecimiento a temperaturas de 4, 14, 25, 35 y 55°С. UVR: Resistencia a la LUV; Rtemp: Resistencia a la temperatura.
UVR: Resistencia a la LUV; Rtemp: Resistencia a la temperatura.
Promedio y variación de la primera agrupación de aislamientos del hongo Beauveria bassiana, en las variables evaluadas.
Promedio y variación de los nuevos grupos de aislamientos del hongo Beauveria bassiana, en las variables evaluadas.