Abstract
The fallen infested coffee berries are the main cause of reinfestation by the coffee berry borer (cbb), Hypothenemus hampei (Ferrari), in coffee plantations at the end of the harvest period. Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin, is the main natural mortality factor of cbb present in all the colombian coffee regions infested by this insect, on the other hand Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin, is considered an entomopathogen that could have an effect on cbb.
This research was aimed to evaluate the effect of soil sprays of the entomopathogens B. bassiana and M. anisopliae, on borers emerging from fallen berries through time. The study was conducted at the Experiment Substation "Maracay" of Cenicafe, near Armenia, Colombia, where two coffee plots of 5000 mβ of the Colombian variety in the third harvest were selected; the two species of fungi were evaluated separately in one plot. Nine treatments with ten replications including the control, were arranged in each plot under a complete randomized design. The experimental plot consisted of nine trees on which only green uninfested berries were left in an optimal stage for ebb attack; the central tree in this plot was selected as the experimental unit and was completely covered by a fine screen cage to avoid the escape or entrance of insects. Conidia used from both fungi were suspended in emulsified oil and water using a dosage of 1x 10" conidia/tree. On the soil under each tree, used as experimental unit, 350 coffee infested berries were deposited to serve as the source for aerial infestation of the trees. Treatments consisted of the spray of the fungus to the base of the trees the same day of infestation, and 2, 5, 10, 15, 20, 25 and 30 days after infestation. Evaluation was made 30 days after treatments registering the infection by both fungi on ebb present on infested berries on the branches of the trees.
Results showed that the proposed methodology is adequate to simulate the emergence of borers from infested berries fallen on the soil and to evaluate treatments against the borer on the soil. Infection levels of both fungi on ebb were the highest during the first five days, reaching nearly 30% for B. bassiana and 11% for M. anisopliae; however the infection decreased and again reached a new peak towards the 25th day evaluation with 24.3 for B. bassiana and 7.7 for M. anisopliae. These results can be explained by the phenomenon of microconidiation or the formation of propagules in microcycles in the soil by these entomopathogens, due probably to the accumulation of infected conidia on insects that infect others to perpetuate the microorganism. In relation to the recovery of these fungi from soil, it was found to be in agreemem to results on infection on berries on the trees. The two species were recovered even after two months and fluctuation in numbers of colony forming units was due probably to the rain precipitation during the study period and the fungus microcomdiation.
These fungi can remain infective in the soil for many days and can increase their inoculum as was shown in this study without the presence of the host insect. B. bassiana was shown to be more infective than M. anisoplice something that was not expected at the start of this research. Efficiency of these fungi could be increased if improvements are made to the formulations, i.e.. using a granulated formulation, to avoid drainage of the conidia from the soil during heavy rainy seasons.
Introducción
El problema de la broca del café, Hypothenemus hampei (Ferrari), no se limita a las poblaciones en frutos de la parte aérea de la planta, sino a los frutos infestados que caen al suelo prematuramente o por electos de la cosecha. Tradicionalmente los frutos caídos y especialmente aquellos que caen durante la cosecha no son recolectados, debido a que esta práctica es dispendiosa para los recolectores y muy costosa.
Estudios previos (Chamorro et al 1995) han demostrado que en Colombia cerca del 10% de la cosecha no se recoge y muchos de estos frutos terminan en el suelo. Según Cárdenas 4 , durante la cosecha se caen cerca de 100 frutos/árbol de acuerdo con observaciones llevadas a cabo en la estación central Naranjal de Cenicafé en Chinchiná, Colombia. El número de frutos caídos es mayor en árboles viejos y aproximadamente el 47% corresponde a frutos verdes y el 53% a frutos maduros y sobremaduros. Los frutos verdes no son reservorios importantes de broca, porque cuando caen, estos contienen sólo una hembra con algunos huevos y en las condiciones de ese sitio estos frutos se descomponen rapidamiente no permitiendo el desarrollo de la población. El mayor numero de estados de la broca se presenta en fratos maduros y sobremaduros, como tambien lo comprobaton Ochoa et al. (1990) en Guatemala.
Comprender la dinámica de la broca en el suelo es importante para contrarrestar sus poblaciones. Estudios llevados a cabo en Mexico (Baker 1984) y en Colombia (Ruiz 1996) han demostrado que las lluvias son la causa principal de la emergencia de las brocas de frutos en el suelo. Por otra parte la humedad alta en los frutos en el suelo causan la expulsión y muerte de los estados inmaduros de la broca (Baker et al. 1994). En los periodos secos la broca permanece en los frutos en el suelo y sigue reproduciéndose por lo que cuando llega el periodo lluvioso se producen emergencias masivas que incrementan considerablemente los niveles de infestación.
M. anisopliae y B. bassiana presentan actividad en el suelo y los factores que la afectan han sido estudiadas por varios autores (Gaugler et al. 1989: Li y Holdom 1993). Extractos acuosos del suelo inhibieron la germinación y el crecimiento de B. bassiana y Paecilomyces farinosus (Holm) Brown y Smith, pero esta inhibición fue mayor en suelos ricos en humus. Esto posiblemente se debe a una fungistasis por cambios de pH dada por la descomposición del material orgánico por microorganismos o por compuestos que alteran la actividad de los hongos entomopatógenos aplicados al suelo (Clerk 1969). Por otra parte la inhibición o Tungistasis sobre estos hongos en el suelo es contrarrestada por la presencia de insectos hospedantes que ayudan a la permanencia del inoculo (Clerk 1969: Groden y Lockwood 1991). Otra forma de corregir la fungistasis es la adición al suelo de componentes ricos en quitina (Pereira et al. 1993).
La formulación de los hongos influye sobre su permanencia y recuperación en el suelo. Un gran porcentaje de propágulos se recupera dentro de los primeros 5 cm de superficie después de la aplicación para las preparaciones en agua) en aceite. La mayor penetración vertical de los propágulos en el suelo ocurrió cuando las conidias se suspendieron solamente en agua, comparadas con las formulaciones en acette. La recuperación de colomas de B. bassiana de parcelas tratadas con formulaciones granulares es 10 veces mayor que la recuperación de colonias en parcelas donde se realizaron aspersiones acuosas (Storey et al.1987.1989; Storey y Gardner 1987, 1988).
Factores como la temperatura, la actividad del agua y las características físicas del suelo influyen en la permanencia y viabilidad de conidias a través del tiempo. Studdert et al. (1990) encontraron que las conidias de B. bassiana depositadas en un suelo cubierto con arcilla a 50 C. no se recuperan después de dos semanas. La vida media alcanzó 44.4 semanas a 10°C y 10 bars de potencial de agua. en contraste la vida media más corta fue de solo 0.3 semanas en un suelo arado a 0 bars y 28-C.
Variaciones en la cantidad de propágulos de un entomopatógeno en el suelo después de su aplicación ha sido observada aunque sus causas no han sido elucidadas (Müller-Koeler y Zimmermann 1986). Otros investigadores indican que la incidencia de hongos sobre insectos en el suelo se ve favorecida con el fenomeno de microconidiación, que explica la supervivencia de éstos durante mucho tiempo debido a la capacidad de desarrollar nuevos propágulos en el curso de microciclos de formación de conidias (Fargues y Robert 1985; Lingg y Donaldson 1981). López et al. (1995) estudiaron bajo condiciones de laboratorio la viabilidad de B. bassiana en suelo estéril y no esteni, logrando recuperarlo hasta 218 días después de su inoculación. El número de conidias viables recuperadas declinó con el tiempo. observándose un incremento inesperado en el número de unidades formadoras de colonias a los 41 días en suelo estéril y no estéril.
La presente investigación se llevó a cabo pusa determinar el papel que ejercen los entomopatógenos B. bassiana y M. ansopliae en la regulación de las poblaciones de broca que emergen de frutos caídos y su estabilidad en el suelo a través del tiempo.
Cárdenas, R. Informe de labores. Disciplina de Entomología, Cenicafé, 1996.
Materiales y Métodos
El estudio se desarrolló durante el segundo semestre de 1996 en la Subestación Experimental "Maracay" de Cenicafé localizada cerca a Armenia. Quindío. Dos lotes, cada uno de 5000 mβ con 2500 plantas de café var. Colombia en producción de tercera cosecha, fueron seleccionados para distribuir independientemente los tratamientos con B. bassiana y M. anisopliae. Los análisis de suelos indicaron un pH de 5.1 para ambos lotes y el contenido de materia orgánica fue de 12% para el lote de B. bassiana y de 16.5% para el lote de M. anisopliae. Una evaluación previa de infestación por broca mostró niveles inferiores al 1.5%.
Los lotes se revisaron, asegurando que tuvieran árboles con un número suficiente de frutos verdes en estado óptimo de infestación por la broca. Posteriormente se delimitaron parcelas de 9 árboles dispuestos en cuadro, separados entre sí por tres surcos en todas las direcciones, en donde se seleccionó el árbol central como la unidad experimental para realizar los registros de infestación e infección por los hongos.
Una vez delimitadas las parcelas, se cubrió el árbol central o la unidad experimental con una jaula entomológica hecha en tela tul transparente, para evitar la entrada y salida de insectos; esta tela permitió la entrada de luz y de lluvia. A la unidad experimental. antes de aplicar los tratamientos se le retiraron todos los frutos maduros, sobremaduros sanos y brocados y los verdes brocados, dejando solo los verdes sanos. Del plato de cada árbol, se retiraron todos los frutos presentes.
Los hongos B. bassiana aislamiento Bb 9205 > M. anisopliae aislamiento Ma 9236 se produjeron artesanalmente en arroz (Antia et al. 1992) previamente reactivados sobre broca. En la preparación de la premezcla se usó Tween-20 y un aceite de uso agrícola emulsionable por partes iguales, para facilitar en primer lugar la homogeneización de las esporas en la mezcla dada por el detergente y para asegurar una buena adhesividad de la preparación a los frutos del suelo, dada por el aceite. La premezcla se adicionó a las esporas del hongo y luego se completó con agua hasta obtener la concentración necesaria para las aspersiones (1x109 c/árbol), la que se asperjó con un equipo de presión previa retenida. a razón de 50 ml en el plato de cada árbol.
Para evaluar los tratamientos se procedió a hacer una infestación con 350 frutos brocados en el plato del árbol de la unidad experimental. Estos frutos se seleccionaron. descartando los vanos y aquellos con presencia de B. bassiana. Posteriormente se desinfectaron con una solución de hipoclorito de sodio al 2.75%. sumergiéndolos tres veces en agua para eliminar el exceso del desinfectante: luego se secaron durante 12 horas con la ayuda de un ventilador. El número de frutos se estableció de acuerdo a los resultados de un preensayo que aseguró una población suficiente sobre la cual realizar las evaluaciones. Cada vez que se hicieron las infestaciones. se tomó una muestra de 10 frutos para comprobar la viabilidad de la población de la broca.
Los tratamientos consistieron en la aspersión de los hongos en el plato de los árboles y posteriormente determinar el efecto sobre la broca que emerge de los frutos colocados en el plato al cabo de 8 intervalos de tiempo (Tabla 1). las cuales se espera que salgan del fruto, entren en contacto con el hongo y vayan a morir infestando frutos en la parte aérea del árbol. El diseño utilizado fue completamente aleatorio con 10 repeticiones, tanto para el lote donde se asperjó B. bassiana como para el de M. anisopliae.
Aspersión de los hongos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae e infestación en el plato de los árboles con frutos brocados días después
En cada parcela experimental, inmediatamente después de las infestaciones, se marcaron 15 ramas/árbol de la parte alta, media y baja. La evaluación de infección por los hongos sobre las brocas, en los frutos infestados en las ramas, se realizó 30 días después de la infestación en el suelo. contabilizando el número de adultos infectados del total de adultos encontrados en los frutos de las 15 ramas.
Los frutos brocados se disectaron para cuantificar la mortalidad de la broca y los adultos muertos se llevaron individualmente a cámaras húmedas durante 8 días para establecer el agente causal de la muerte. La evaluación se registró como el número de adultos de broca muertos por cada uno de los hongos en relación con el total de la población encontrada en cada una de las parcelas o sea sobre las 15 ramas.
Para evaluar la persistencia en el suelo de las esporas de los hongos asperjados se utilizó el método de dilución para la recuperación de Unidades Formadoras de Colonias (UFC/g) de suelo muestreado, para establecer cuanto tiempo pueden permanecer activas. Los muestreos se realizaron semanalmente durante dos meses en las unidades experimentales, tomando al azar 10 gr de suelo/sitio de 5 sitios diferentes. Estas 5 muestras se homogenizaron y se usó 1g para el análisis el que se diluyó en 9ml de agua destilada estéril: para realizar las stembras microbiológicas se tomó una muestra de 0,1ml. La recuperación de los hongos se determinó mediante su aislamiento en medios de cultivo selectivos y se registró como UFC/gr de suelo. El número de colonias recuperadas se calculó con la fórmula:
donde: k es igual a la dilución utilizada (1, 2, 3, etc.)
Resultados y Discusión
Los resultados se presentan en las tablas 2 y 3 y muestran que la metodología ideada es apropiada para realizar estas evaluaciones. En todos los tratamientos se presentó infestación por la broca en la parte aérea de la planta como consecuencia de la emergencia de los frutos desde el suelo donde fueron depositados. A pesar de que se colocó un número fijo de frutos brocados en el suelo. estos dieron lugar a diferentes niveles de infestación en cada uno de los tratamientos. Tanto B. bassiana como M. anisopliae se encontraron infectando la broca en la parte aérea evidenciando el contacto con el hongo al dejar los frutos en el suelo. La infección sobre la broca fue mayor para los tratamientos en que el hongo fue asperjado después de 0. 2 y 5 días de la infestación siendo más alta para B. bassiana (Tabla 2) en donde se alcanzaron niveles cercanos al 30% que para M. anisopliae (Tabla 3).
Infección (%) de Beauveria bassiuma (Bb) asperjado al suelo sobre adultos de Hypothenemus hampei que emergen de tratos intestados, colocados días después de la aspersión (DDA)
Promedios seguidos por la misma letra no difieren significativamente de acuerdo con la prucha de Tukey (l'<0,05).
Infección (%) de Metarhizium anisopliae (Ma) asperjado al suelo sobre adultos de Hypothenemus hampei que emergen de frutos infestados, colocados días después de la aspersión (DDA)
Promedios seguidos de la misma letra no difieren significativamente de acuerdo con la prueba de Tukey (P>0.05)
Los niveles de infección decrecieron en las evaluaciones siguientes (10. 15 y 20 días después). hasta los 25 días. tiempo después del cual la incidencia del hongo sobre la broca se incrementó nuevamente hasta niveles similares a los ocurridos durante los primeros días después de la aspersión. La causa de este incremento se atribuye a la microconidiación ó formación de nuevos propágulos a partir de los existentes y que parece que se presenta solo cuando los hongos son aplicados al suelo. como ha sido documentado por otros autores (Fargues y Robert 1985: Lingg y Donaldson 1981).
La evaluación de infección sobre la broca para el lote donde se asperjó M. anisopliae. mostró un comportamiento similar a donde se asperjó B. bassiana; sin embargo los niveles de infección fueron inferiores (Tabla 3). Los porcentajes de infección en los 5 primeros días después de la aspersión, oscilaron entre 7,9% y 11%. Estos niveles decrecieron paulatinamente hasta 4,5% durante los siguientes thes tratamientos. A los 25 días después de la aspersión, la incidencia se incrementó nuevamente hasta 7,7%: 30 días después de la aspersión los niveles disminuyeron de nuevo. Resultados similares han sido registrados por Müller-Kögler y Zimmermann (1986) en estudios de control del Leptinotarsa decemlineata usando B. bassiana.
En relación con la persistencia en el suelo de B. bassiana y M. anisopliae en los lotes donde se asperjaron (Figs. 1 y 2) se logró su recuperación aún después de los dos meses de evaluación: paradójicamente se encontraron las dos especies en cada lote. sin embargo B. bassiana en ambos casos fue más abundante. Lo anterior se puede explicar por la posible presencia del hongo como consecuencia de aspersiones realizadas en la Subestación en programas de control de la broca del caté.
Recuperación (UFC/g) del suelo de B. bassiana (Bb) y de otros entomopatógenos (M. anisopliae (Ma), Paecilomyces lilacinus (Pl)), días después de la aspersión.
Recuperación (UFC/g) del suelo de M. anisopliae (Ma) y de otros entomopatógenos (B. bassiana (Bb), Paecilomyces lilacinus (Pl)), días después de la aspersión.
No se detectó una relación directa entre la abundancia de UFC de los hongos y la precipitación, aunque si se cuantificó una reducción después de altas precipitaciones (Figs. 1 y 2). Para el caso del lote con B. bassiana se pueden observar picos al inicio y al final de las evaluaciones que corresponden a lo que se encontró en la parte aérea de los árboles con los niveles de infección y que se cree son un resultado de la conidiación en ciclos en el suelo (Fig. 1).
La dinámica en el suelo de M. anisopliae fue similar a la de B. bassiana: sin embargo. la recuperación fue significativamente menor, contrario a lo que se esperaba. Por otra parte se detectó la presencia de una gran cantidad de inóculo de B. bassiana que en la mayoría de las evaluaciones fue superior a M anisopliae (Fig. 2).
Durante los muestreos de suelo se aisló frecuentemente, de ambos lotes, otro hongo entomopatógeno Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson, identificado por Harry C. Evans del IIBC en Inglaterra, el cual se registra aquí por primera vez no sólo aislado del suelo en los medios selectivos (López et al. 1995), sino sobre adultos de la broca del café en condiciones naturales. Este hongo ha sido aislado previamente de suelos cafeteros en Colombia con altas poblaciones de nemátodos del género Meloidogyne, pruebas in vitro han mostrado su patogenicidad (Cardona 1995).
Una observación que vale mencionar. es que durante la labor de disección de frutos. se presentaron adultos de broca con movimientos continuos, sin presentarse la muerte. Este fenómeno puede ser atribuido a que el contacto con un número suficiente de esporas no se dió o a que son individuos resistentes al ataque de estos hongos. permaneciendo en estado de cofermedad crónica. pero sin tener un impacto letal sobre ellos.
La incidencia de los hongos se midió solamente observando la infección sobre adultos atacando los frutos de los árbolos: sia embargo, es posible que una parte de los adultos presentes en los frutos del suelo, no alcancen a volar hasta los frutos de los irboles y mueran pasando desapercibidos. Esta parte de la población no se tiene en cuenta al hacer los análisis de intección. siendo necesario analízar este factor en futuros estudios.
Una mayor eficacia de estos hongos en el suelo se podría lograr con formulaciones mais apropiadas que eviten el lavado por las lluvias. mantengan la viabilidad de las conidias y se mantengan en las capas superficiales para propiciar el contacto con el insecto, como lo sugieren las diferentes investigaciones de Storey et al.(1989).
Footnotes
Agradecimientos
Los autores expresan sus agradecimientos al Ing. Agr. Luis Fernando Machado por la colaboración prestada para el desarrollo del estudio en la Subestación Experimental Maracay de Cenicaté.