Abstract
The 94 kDa protein (MED94) of: B. thuringiensis subsp. medellin has been recognized as tha main toxicity factor of this bacterium to mosquito larvae. From a genomic library evaluated by inmunoblot with polyclonal antobodies raised against MED94, it was possible to identify, clone, and sequence the gene encoding this endotoxin. This report describes the subcloning procedure of this gene using the phagemid pBlueScript SK(-) as a donor of a 3.3 kpb fragment flanqued EcoRI-HindIII (RH3). Two shuttle vectors (pBU4 y pMK3), harbouring replication origins compatible with B. thuringiensis, were the receptors of the gene. These plasmids differ in source, copy number, selection marker, and structural-segregational stability. The transforming procedure of B. thuringiensis subsp. israelensis through electroporation with each construct, gave rise to recombinant strains of B. thuringiensis subsp. israelensis 4Q2-81 (acrystalliferous strain) and B. thuringiensis subsp. israelensis 1884 (H14 serotype, used in commercial formulations), this strain expressed the introduced gene, according to Western blot and toxicity bioassays results. Recombinants were tested by means of Southern blot experiments to detected the presence and integrity of the introduced gene, it was also analized the expression of native δ-endotoxins of B. thuringiensis subsp. israelensis 1884. The half letal concentration (LC50) of crystal protein was estimated bay Probit analysis, as a measure of the toxicity against third instar larvae of Aedes aegypti exposed to samples of the purified parasporal crystals, and compared to the toxicity produced by native strains.
Introducción
La proteína de 94 kDa de Bacillus thuringiensis subesp. medellin (MED94) se asemeja en tamaño, actividad y secuencia a la toxina Cry11Ba de B. thuringiensis subesp. jegathesan y en menor grado a la toxina Cry11Aa de B. thuringiensis subesp. israelensis (Orduz 1997); los genes que codifican estas toxinas han sido clonados y expresados, tanto en Escherichia coli como en mutantes acristalíferos de B. thuringiensis. Se ha observado que la toxicidad de cada proteína hacia larvas de mosquitos es inferior, comparada con los cristales completos de las cepas silvestres de donde provienen, no obstante existen diferencias importantes entre las tres toxinas mencionadas de cuerdo con la especie de mosquito analizada; así, la toxina Cry11Ba exhibe la mayor potencia contra larvas de Culex quinquefasciatus, mientras que, tanto esta proteína como Cry11Bb, son más tóxicas que Cry11Aa contra larvas de Anopheles albimanus y Aedes aegypti (Orduz 1997; Restrepo et al. 1997).
El gen que codifica la proteína Cry11Aa ha sido clonado, evaluado individualmente y en combinación con el gen que codifica la toxina Cyt1Aa también de B. thuringiensis subesp. israelensis, encontrándose que en combinación, son el factor más importante para la toxicidad de B. thuringiensis subesp. israelensis hacia larvas de Culex pipiens y A. aegypti, sin embargo, no supera el efecto tóxico del cristal parasporal completo (Poncet et al. 1993; Wirth et al. 1996). Adicionalmente B. thuringiensis subesp. israelensis sintetiza tres δ-endotoxinas más, Cry4Aa (135 kDa), Cry4Ba (125 kDa) y Cry10Aa (72 kDa) (Delécluse 1991), las cuales sumadas a las anteriores, exhiben sinergismo en su actividad tóxica (Angsuthanasombat et al. 1992; Tabashnick 1992).
A nivel de laboratorio es posible seleccionar mosquitos resistentes a las toxinas de B. thuringiensis subesp. israelensis y el tiempo requerido es directamente proporcional al número de toxinas diferentes que se emplee en la selección (Georghiou y Wirth 1997), lo cual exige empezar a regular el uso de esta cepa como agente de control biológico y planear estrategias para disminuir el riesgo de desarrollo de resistencia (WHO/TDR 1996). Ante ello, se cuenta hoy en día con otras dos cepas muy potentes contra mosquitos y que poseen toxinas diferentes a aquellas de B. thuringiensis subesp. israelensis, son ellas B. thuringiensis subesp. jegathesan y B. thuringiensis subesp. medellin. Una estrategia a considerar sería la manipulación de los genes que codifican estas últimas toxinas con el objeto de incrementar la actividad larvicida de estas bacterias.
En este trabajo se transfirió el gen que codifica la toxína MED94 de B. thuringiensis subesp. medellin a B. thuringiensis subesp. israelensis, haciendo uso de vectores de clonación bifuncionales, con el propósito de estudiar su expresión en huéspedes homólogos y evaluar su viabilidad como estrategia para incrementar la efectividad de los métodos de control biológico disponibles hasta ahora.
Materiales y Métodos
Manipulación de cepas bacterianas
Las cepas de E. coli se cultivaron en LB (2.0%-Bacto Triptona, 0.5%-Bacto Yeast Extract, 10 mM-NaCl, 2%-Agar, pH 7.2). Las cepas de B. thuringiensis se cultivaron en LB ó en medio M1 (Orduz et al. 1992). Las cepas usadas se describen en la tabla 1.
Los cultivos de E. coli se mantuvieron a 37°C durante 15 h mientras que las cepas de B. thuringiensis se cultivaron durante 15 h a 30°C para la selección de recombinantes y durante 48 h ó más para lograr la producción de cristal parasporal y evaluar su toxicidad; en medio líquido los cultivos se mantuvieron a 200 rpm. Como antibiótico de selección se usó ampicilina para las cepas de E. coli (80-100 µg/ml); mientras que para B. thuringiensis se usó tetraciclina (30-35 µg/ml) ó kanamicina (50-60 µg/ml).
La producción de esporas y cristales fue monitoreada por microscopía de luz después de colorear muestras de los cultivos con verde de malaquita y safranina como colorante de contraste, según modificación de la técnica señalada por Hendrickson y Krenz (1991). Para la transformación de E. coli, se siguieron metodologías estándar (González et al. 1995), similarmente se electrotransformó B. thuringiensis de acuerdo con las técnicas descritas por Bone y Ellar (1989) y Lereclus et al. (1989).
Subclonación y transformación
Los procedimientos para manipulación del DNA se hicieron de acuerdo con metodologías estándar (Sambrook et al. 1989). Esquemáticamente el procedimiento se resume en la Figura 1. Se usaron sistemas comerciales de extracción y purificación de DNA plasmídico a partir de E. coli (Wizard de Promega, Madison, WI, USA; Quantum Prep y Prep-a-Gene de BioRad, Hercules, CA, USA). Las reacciones de corte y ligación sobre el ADN se efectuaron con endonucleasas de restricción y T4 ADN-ligasa adquiridas de Amersham (Buckinghamshire, UK) y New England Biolabs (Beverly, MA, USA). La elución de ADN a partir de agarosa se realizó por el método del nitrógeno líquido (Tautz y Renz 1985).
Se usaron como cepas-huésped de plásmidos las incluidas en la tabla 1, E. coli SOLR mantuvo el fagémido pBlueScript SK(-) recombinante procedente por excisión in vivo del sistema de clonación Lambda Zap II/EcoRI/CIAP (Stratagene, La Jolla, CA, USA) y E. coli SURE porta el fagémido con el fragmento RH3 que se subclonó; E. coli XL1-BLUE MRF' se usó como huésped intermedio en el proceso de subclonación a vectores bifuncionales para selección estricta por α-complementación del sistema reportero lacZ (selección blanco/azul). E. coli JM83 y E. coli JM109 sirvieron como fuente de los vectores bifuncionales, pBU4 y pMK3, respectivamente.
Los vectores bifuncionales que sirvieron como receptores del gen fueron dos. pMK3 (Sullivan et al. 1984), derivado mediante fusión de pUB110 (plásmido de resistencia a kanamicina original de Staphylococcus aureus) y pUC9 de E. coli; y el vector pBU4 (Bourgouin et al. 1990), producto de la fusión de pBC16(1 (fragmento EcoRI-EcoRI del plásmido de resistencia a tetraciclina pBC16 de B. cereus) y pUC19 de E. coli. El fagémido donador pBlueScript SK(-) tiene 3.0 kpb; el gen está incluido en un segmento denominado RH3 de 3.3 kpb flanqueado EcoRI-HindIII en la cepa E. coli SURE, orientado 5'-3' respecto al gen reportero lacZ (Fig. 1).
El inserto RH3 fue subclonado en el vector pBU4 haciendo uso de los extremos cohesivos dejados por EcoRI y HindIII (5' y 3' respectivamente) mientras que, para el vector pMK3, se usaron las secuencias de corte para PstI corriente arriba del extremo 5' y SalI corriente abajo del extremo 3', de tal manera que la orientación del gen se mantuvo 5'-3' tal como en el fragmento original (Fig. 1). Luego de obtener los recombinantes de E. coli, se extrajeron los plásmidos por el método de lisis alcalina (Birnboim y Doly 1979) y luego fueron introducidos a través de electrotransformación en una cepa acristalífera de B. thuringiensis subesp. israelensis designada 4Q2-81. Esta cepa realizaría el procedimiento de modificación propio de B. thuringiensis subesp. israelensis, el cual posteriormente permitiría introducir los plásmidos recombinantes en la cepa tóxica para mosquitos B. thuringiensis subesp. israelensis 1884.
SUBCLONACION EN VECTORES BIFUNCIONALES. Se ilustra el fragmento E-H de 3.3 kpb (RH3) como parte del fagémido recombinante pRH3 y se indican las endonucleasas relevantes para subclonación. Nótese la orientación del fragmento y compárese con su orientación en el polylinker de los vectores bifuncionales; para pBU4 se usaron los sitios E y H mientras que para pMK3 se usaron P y Sa, en cada caso el fagémido original se cortó con las mismas enzimas que el vector. S SacI, X XmaI, B BamHI, Sm Smal, P Pstl, E EcoRI, H HindIII, C Clal, Sa Sall, Hi HincII, K KpnI, A AccI, Sp Sphl.
Cepas Bacterianas Utilizadas en este Estudio con sus Respectivos Marcadores Genéticos y Procedencia.
E. coli Escherichia coli. Bti Bacillus thuringiensis subesp. israelensis. Btmed Bacillus thuringiensis subesp. medellin
Evaluación de la presencia del gen introducido
Se efectuó Southern blot (Southern 1975) e hibridización específica usando el sistema directo de marcación y detección de ADN ECL (Amersham, Buckinghamshire, U.K.). El ADN plasmídico de las cepas recombinantes fue obtenido siguiendo el método de lisis alcalina y se sometió a digestión con EcoRI y HindIII para luego separar los fragmentos en agarosa y transferirlos a membranas de nylon con carga positiva.
La membrana se sometió a hibridización con una sonda de 527 pb. obtenida por corte con XbaI sobre el subclón pRH3, que comprende 30 pb. del polylinker de pBlueScript SK(-) más los primeros 497 pb. del inserto EcoRI-HindIII que incluyen el extremo 5' del gen entre los nucleótidos 173 y 497 donde se ha observado que yace la variabilidad de los genes cry (Lereclus 1988; Thompson et al. 1995). Previamente se evaluó la especificidad de esta sonda según análisis comparativo de secuencias con el programa de computador MacDnasis (Hitachi Software Engineering Co., San Bruno, CA), y experimentalmente, mediante dot-blot (resultados no mostrados).
Evaluación de la expresión del gen introducido
Se prepararon cultivos líquidos de 48 h con cada una de las cepas de B. thuringiensis silvestres y recombinantes en medio de esporulación M1, para electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida denaturante con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE); se cosecharon 500 µl. de cultivo completo final, se lavó el precipitado 2 veces por centrifugación con 1.0 ml de agua estéril y luego se incubó en NaCl 1.0 M durante 30 minutos a 37 °C; posteriormente, las células fueron sometidas a 2 lavados más y se resuspendieron en 50 µl. de buffer Laemmli (Ausubel et al. 1995).
Luego de su separación por electroforesis, las proteínas se electro-transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se realizó detección específica de MED94 mediante anticuerpos policlonales generados en ratón (Orduz et al. 1996); en forma separada, se realizó detección de las proteínas tóxicas de B. thuringiensis subesp. israelensis 1884 (Cry4Aa, Cry4Ba, Cry11Aa y Cyt1Aa) usando una mezcla de los respectivos anticuerpos policlonales específicos para cada una (suministrados por la Dra. Armelle Delécluse, Instituto Pasteur). Luego, se reveló el complejo antigeno-anticuerpo usando anticuerpos de cabra anti-ratón acoplados a fosfatasa alcalina (BioRad, Hercules, CA, USA) como anticuerpo secundario y se detectaron con substratos formadores de color, en tampón carbonato pH 9.6. Después de confirmar la expresión del gen introducido usando cultivo completo final para la selección de las cepas transformadas, se repitió el Western blot con los cristales parasporales para analizar su composición.
Análisis de actividad tóxica
Se incubaron cultivos líquidos en 250 ml de medio M1 a 200 rpm y 30°C durante 48 h.; se adicionó a cada uno 500 ml de agua estéril y se incubaron, adicionalmente, hasta esporulación máxima. Se realizó entonces la purificación de cristales mediante extracción orgánica en un sistema de bipartición líquido-líquido con CCl4 y Na₂SO₄ (Otieno-Ayayo et al. 1993).
Las muestras enriquecidas en cristales se sometieron a solubilización en una solución 0.05 N de NaOH incubando a 37°C durante 1 h y precipitando 30 minutos a 12.000 rpm y 4°C; posteriormente, se tomó el sobrenadante y se determinó la concentración de proteínas siguiendo la metodología recomendada en el sistema Protein Assay (BioRad, Hercules, CA., USA). Se usaron diluciones 1:500 y como estándar, albúmina de suero bovino (BSA).
Posteriormente se dispusieron bioensayos de toxicidad tratando larvas de tercer ínstar de A. aegypti con diferentes concentraciones de cristales (20 individuos por tratamiento en 100 ml de agua microfiltrada) y tres réplicas de acuerdo con metodologías estándar, con tres repeticiones en días diferentes (Orduz et al. 1992). Como control positivo, se adicionaron 100 µl de un cultivo completo final de 48 h de B. thuringiensis subesp. medellin en medio M1. Los bioensayos para determinar la actividad tóxica se realizaron a 30°C y la lectura de mortalidad se hizo al cabo de 24 h. Mediante análisis Probit se estimó la concentración letal media (LC50) para cada cepa con un programa de computador desarrollado por E. Frachon en el Instituto Pasteur, este análisis se realizó en un computador Macintosh Performa 630.
Resultados
Obtención de plásmidos y cepas recombinantes
Como producto del proceso de subclonación se obuvieron dos plásmidos recombinantes que se designaron pBTM5 y pMAR3 (RH3 subclonado en pBU4 y en pMK3, respectivamente). Al cortar con EcoRI y HindIII el primer vector (pBU4), produjo un fragmento de 5.5 kpb mientras que el segundo formó dos, de 5.4 kpb y 1.8 kpb, el inserto RH3 fue de 3.3 kpb aproximadamente (Figs. 1 y 2A).
En la transformación de E. coli se observó una eficiencia aproximada de 105 transformantes/ µg de ADN al usar células competentes preparadas y almacenadas a -70°C, lo cual no fue muy diferente a la eficiencia mostrada por células competentes adquiridas comercialmente (105-106 transformantes/µg de ADN). En la electrotransformación de B. thuringiensis se observó baja eficiencia (entre 10 y 102 transformantes/µg de ADN); sin embargo, ello fue suficiente para seleccionar clones positivos (resistentes al antibiótico de selección) y confirmar luego, mediante análisis de restricción, la integridad de los constructos dentro de cada cepa (Fig. 2A). Además se demostró expresión de la proteína recombinante mediante Western blot y pruebas de toxicidad sobre larvas de tercer ínstar de A. aegypti.
Evaluación de la presencia del gen introducido
Al ser cortado con las endonucleasas de restricción EcoRI y HindIII el ADN plasmídico extraído de cada uno de los recombinantes de E. coli JM109, B. thuringiensis subesp. israelensis 4Q2-81, y B. thuringiensis subesp. israelensis 1884, se encontraron las señales esperadas para los plásmidos recombinantes, aparentemente sin modificación estructural alguna. En la Figura 2A se observa que en las líneas 7 y 14 (pRH3 y p3A6.1A, respectivamente) se presenta un fragmento aproximadamente de 3.3 kpb que corresponde al inserto RH3 subclonado en los vectores mostrados en los carriles 3 y 10 (pBU4 y pMK3, respectivamente); así se confirma la presencia en cada cepa, de los plásmidos recombinantes pBTM5 (líneas 4, 5 y 6) y pMAR3 (líneas 11, 12 y 13).
Posteriormente, se evaluó si el fragmento subclonado correspondía al gen mediante hibridización con la sonda XbaI sobre el ADN separado en gel y transferido a membranas de Nylon con carga eléctrica positiva. Se generaron señales para el inserto RH3 (aproximadamente 3.3 kpb) en todas las cepas que lo portan, tanto de E. coli (carriles 4 y 11), como de B. thuringiensis subesp. israelensis 4Q2-81 (carriles 5 y 12) y B. thuringiensis subesp. israelensis 1884 (carriles 6 y 13), se confirma así la identidad del fragmento subclonado (Fig. 2B).
Evaluación de la expresión del gen introducido
Para analizar si el gen introducido se expresaba como una proteína Cry (haciendo parte del corpúsculo parasporal), se purificaron cristales de cada cepa y se separaron las proteínas mediante SDS-PAGE; luego se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se pusieron en contacto con anticuerpos contra MED94 de B. thuringiensis subesp. medellin (Fig. 3B), ό con anticuerpos contra las δ-endotoxinas de B. thuringiensis subesp. israelensis (Fig. 3A). Se encontró que la proteína MED94 se expresó individualmente tanto en B. thuringiensis subesp. israelensis 4Q2-81 (líneas 9 y 10), como en la cepa 1884 de B. thuringiensis subesp. israelensis (líneas 12 y 13). Además, esta última cepa expresó simultáneamente sus propias proteínas Cry (carriles 3 y 4) que hacen parte del cristal parasporal.
En los recombinantes y la cepa silvestre de B. thuringiensis subesp. medellin, la movilidad electroforética mostrada por la proteína MED94 coincidió con una banda de 94 kDa aproximadamente. No obstante al observar la expresión del gen introducido y los genes nativos de B. thuringiensis subesp. israelensis, la esporulación y formación de cristal parasporal sufrieron un retraso significativo en las cepas transformadas; la tabla 2 reúne los datos de tiempo que cada cepa necesitó para alcanzar el 80% de esporulación.
Actividad tóxica
Los cristales producidos por las cepas recombinantes adoptaron formas variadas (redondos, ovoides, alargados); como pauta general, tendieron a ser de mayor tamaño y amorfos.
Se registraron los datos de mortalidad correspondientes a cada preparación de cristales y se estimó la LC50; al respecto, las cepas silvestres mostraron el patrón de toxicidad característico (Orduz et al. 1992); el valor de toxicidad obtenido con los dos recombinantes de la cepa 4Q2-81 (uno con cada constructo) fue muy semejante entre sí y solo levemente inferiores a los recombinantes de B. thuringiensis subesp. israelensis 1884. La dispersión de los datos experimentales estuvo dentro de rangos aceptables y por ello, la estimación cuantitativa se mostró estadísticamente confiable (Tabla 3). La información derivada de los bioensayos, sugiere que cuantitativamente deben existir cambios importantes en la expresión de las δ-endotoxinas, pues se encontró que las cepas recombinantes de B. thuringiensis subesp. israelensis 1884 exhibieron valores mayores de LC 50 y por tanto, niveles de toxicidad 10 veces inferiores con respecto a las cepas silvestres (Tabla 3).
Tiempo Requerido por cada Cepa Recombinante para Alcanzar la Esporulación en Medio M1.
E. coli Escherichia coli. Bti Bacillus thuringiensis subesp. israelensis. Btmed Bacillus thuringiensis subesp. medellin
Evaluación de la Toxicidad de las Cepas Recombinantes Comparada con las Cepas Silvestres B. thuringiensis subsp. israelensis 1884 y B. thuringiensis subsp. medellin 163-131.
Bti B. thuringiensis subsp. israelensis; Btmed B. thuringiensis subsp. medellin
Calculado a partir de tres experimentos con tres repeticiones en cada uno.
WESTERN BLOT CON PROTEINAS CRISTALINAS DE LOS RECOMBINANTES. Carriles 1 y 15 marcador de peso molecular. Panel A: Carril 2 B. thuringiensis subsp. israelensis 1884 nativo, carril 3 y 4 B. thuringiensis subsp. israelensis 1884 transformado con pBTM5 y pMAR3 respectivamente. Panel B: Carril 5 Escherichia coli con el vector pMK3; carriles 6 y 7 cepa acristalífera de B. thuringiensis subsp. medellin transformada con pBTM5 y pMAR3; carril 8 cepa acristalífera sin transformar; carriles 9 y 10 B. thuringiensis subsp. israelensis 4Q2-81 transformada con pBTM5 y pMAR3; carril 11 B. thuringiensis subsp. israelensis, carriles 12 y 13 B. thuringiensis subsp. israelensis 1884 transformada con pBTM5 y pMAR3; carril 14 B. thuringiensis subsp. medellin. Nótese que los carriles 2 y 13 corresponden a la misma cepa, al igual que los carriles 3 y 12, y los carriles 4 y 13. El panel A fué revelado con anticuerpos dirigidos contra las proteinas cristalinas de B. thuringiensis subsp. israelensis, mientras que el panel B se reveló con anticuerpos dirigidos contra MED94 de B. thuringiensis subsp. medellin.
Discusión
Desde el comienzo de esta década se han venido desarrollando trabajos de transferencia de genes que codifican toxinas mosquitocidas de B. thuringiensis con resultados muy variables (Porter 1996); sin embargo, se espera que ellos aporten resultados exitosos cuando se depuren los métodos usados y se disponga de mayor conocimiento sobre la expresión de estos genes (WHO/TDR 1996).
Se ha observado que la introducción de plásmidos de alto número de copias en B. thuringiensis ocasiona importantes efectos que se manifiestan por la inestabilidad segregacional y estructural de los vectores, además de perturbar fisiológicamente a la bacteria en lo que respecta al conjunto de eventos que dan lugar a la esporulación (Agaisse y Lereclus 1995). Sin embargo, en este trabajo no se observó tal inestabilidad como lo evidencia la Figura 2A.
Por otro lado, la expresión de las proteínas tóxicas nativas de B. thuringiensis subesp. israelensis confirma que la introducción del gen que codifica MED94, no ocasionó la pérdida ni interfirió significativamente con la segregación y expresión dependiente del plásmido de 125 kpb de B. thuringiensis subesp. israelensis. Ello sugiere que el origen de replicación del plásmido introducido podría ser compatible con el plásmido nativo como ya fue propuesto (Bron 1990; González et al. 1982; Loprasert et al. 1986; Seyler et al. 1993). Similarmente, la expresión del gen introducido es semejante en la cepa silvestre B. thuringiensis subesp. medellin y las cepas recombinantes obtenidas; lo cual indica que la proteína producida no está sujeta a modificaciones postraduccionales que le ocasionen cambios estructurales adicionales.
Delécluse (1991), al comparar los vectores bifuncionales pBU4, pMK3 y pHT3101, como vehículos para la introducción de genes de B. thuringiensis en B. sphaericus, encontró que los tres vectores dan lugar a retrasos en el crecimiento de los transformantes, siendo menor en el caso del vector pMK3 (vector utilizado en el constructo pMAR3) y mucho mayor con pHT3101. Un elemento a considerar en la elección de un vector de clonación para los genes cry es la relación entre el número de copias del plásmido y el nivel de expresión de la proteína Cry.
El uso de orígenes de replicación propios de B. thuringiensis permite mantener un número de copias igual ó semejante al del plásmido original y ello aseguraría la expresión adecuada del gen introducido. Lo anterior ha sido considerado en algunos trabajos, pero también se han logrado introducir genes con el uso de vectores que poseen orígenes de replicación diferentes, aunque compatibles, con los plásmidos de B. thuringiensis como es el caso de pBC16 (Baum et al. 1990), plásmido fuente del vector pBU4 empleado en este trabajo. Con este último se ha logrado transformar B. thuringiensis subesp. israelensis previamente encontrándose que la esporulación y expresión de las toxinas originales de esta subespecie no se ve alterada en su presencia (Bourgouin et al. 1990). En ese mismo trabajo se demostró que la alteración fisiológica de las cepas recombinantes tiene como causa el gen introducido y no el vector usado, resultado que puede ser extrapolado al trabajo aquí presentado, por lo menos en lo que respecta al constructo pBTM5 que fue formado sobre el vector en mención.
En este trabajo, el análisis por Southern blot confirmó la identidad del gen introducido con base en el resultado aportado por los controles positivos y negativos (Fig. 2, carriles 7 y 14, y carriles 3 y 10). La ausencia de señal en el carril 2 (Fig. 2B) se debe a que el ADN plasmídico fue obtenido por un método propio de plásmidos de bajo peso molecular, mientras que los genes cry de B. thuringiensis se encuentran en plásmidos de muy alto peso molecular como es el caso con el plásmido de 125 kpb (72 MDa) de B. thuringiensis subesp. israelensis (Ben-Dov et al. 1996; Gonzalez et al. 1982), la razón es que estos plásmidos desaparecen en las extracciones debido a fuerzas de cizalladura (shearing forces) que los degradan y los vuelven susceptibles a las nucleasas contaminantes.
En el Western blot (Fig. 3A) se observó señal específica para la δ-endotoxina de 94 kDa de B. thuringiensis subesp. medellin en todos los recombinantes (Fig. 3, carriles 6, 7, 9, 10, 12 y 13), lo que sugiere que la expresión está teniendo lugar incluso como el patrón multibanda característico de la cepa silvestre (carril 14). Al nivel de resolución estudiado, no se observaron diferencias de expresión en cuanto se las relaciona con el tipo de vector bifuncional usado (compárense líneas 6 y 7, 9 y 10, ó 12 y 13). También se observa la expresión, al menos en forma cualitativa, de las δ-endotoxinas nativas en las cepas recombinantes de B. thuringiensis subesp. israelensis, lo cual parece indicar que la expresión de los genes nativos no está disminuida por la expresión del gen introducido, como fue indicado por Bar et al. (1991), quienes usaron un vector derivado de pUB110 (pPL603E) como vehículo para la introducción de todos los genes cry de B. thuringiensis subesp. israelensis en B. sphaericus, ellos obtuvieron recombinantes que mostraron moderada estabilidad y esporulación retrasada (aunque esto no ocurrió en presencia del vector solo). Esta alteración se explicó por el mayor tiempo necesario para expresar los genes de B. thuringiensis subesp. israelensis introducidos pero aún así, no se logró mejorar ostensiblemente la toxicidad de la bacteria hacia larvas de A. aegypti, particularmente, la proteína Cyt1Aa no se alcanzó a expresar y ello pudo hacer parte de las razones que explican la falta de toxicidad.
En el presente trabajo se observó que la toxicidad de las cepas recombinantes de B. thuringiensis subesp. israelensis 1884 hacia larvas de A. aegypti disminuyó en un orden de 10 veces, según lo sugieren los valores aproximadamente diez veces mayores de LC50 comparados con la cepa silvestre (Tabla 3); al nivel de resolución estudiado, no es posible atribuir tal disminución a diferencias cuantitativas de expresión entre los genes nativos y el gen introducido.
El retraso en la esporulación de las cepas recombinantes que fuera observado en este trabajo impidió superar un 80% de células esporuladas, al cabo de siete días de cultivo (Tabla 2). Si se considera el alto nivel de expresión en la cepa donante del gen transferido (Fig. 3, línea 14), es admisible proponer un fenómeno de "saturación de la maquinaria de expresión" (transcripción y traducción involucrando todas las subunidades σ35 y σ28 disponibles de la ARN polimerasa bacteriana), para explicar el retraso en la esporulación; cuando se separaron en gel las proteínas de los cristales extraídos (datos no mostrados), se notó una disminución en la intensidad de la señal correspondiente a las dos δ-endotoxinas Cry4Aa y Cry4Ba de los recombinantes de B. thuringiensis subesp. israelensis, comparada con la cepa silvestre, lo cual podría ser reflejo del fenómeno postulado. En caso de presentarse tal saturación, se retrasa el conjunto de procesos que proceden desde las fases iniciales hasta las fases finales de la esporulación, incluyendo la biosíntesis de las endotoxinas (Pigot et al. 1994).
Este trabajo permitió obtener recombinantes de B. thuringiensis subesp. israelensis 4Q2-81 y B. thuringiensis subesp. israelensis 1884 que expresan la δ-endotoxina MED94 de B. thuringiensis subesp. medellin. Hasta el momento los resultados indican que es factible obtener cepas que soportan los plásmidos recombinantes introducidos; así mismo, se confirma la expresión del gen introducido y la expresión de los genes nativos en B. thuringiensis subesp. israelensis 1884, y se evalúa la toxicidad hacia larvas de A. aegypti; sin embargo, hace falta ampliar el análisis de toxicidad para evaluar el efecto del gen introducido y su papel como parte del arsenal tóxico que caracteriza a esta bacteria y le confiere toxicidad hacia larvas de otras especies de mosquitos.
Conclusiones
El gen que codifica la principal δ-endotoxina de B. thuringiensis subesp. medellin (MED94), puede ser transferido a B. thuringiensis subesp. israelensis cepas 1884 y 4Q2-81, mediante vectores bifuncionales con orígenes de replicación diferentes pero compatibles a los de B. thuringiensis (pBU4 y pMK3). La d-endotoxina MED94 puede ser expresada tanto en el mutante acristalífero 4Q2-81 como en la cepa silvestre B. thuringiensis subesp. israelensis 1884; en esta última, la expresión de las δ-endotoxinas nativas ocurre simultáneamente. La expresión del gen recombinante da lugar a importantes modificaciones fisiológicas que alteran el proceso normal de esporulación, anteriormente se había comprobado que este evento no era debido al vector utilizado. La δ-endotoxina MED94 expresada independientemente en el mutante acristalífero B. thuringiensis subesp. israelensis 4Q2-81, exhibe mayor toxicidad hacia larvas de tercer ínstar de A. aegypti, que cualquiera de las δ-endotoxinas de B. thuringiensis subesp. israelensis 1884 expresadas individualmente. La expresión simultánea de la δ-endotoxina recombinante (MED94) y las nativas, al parecer no genera ningún tipo de efecto aditivo ó sinergismo en la toxicidad hacia larvas de A. aegypti con base en la LC50 observada en cada caso; por el contrario, la actividad tóxica en las cepas recombinantes es 10 veces menor.
Footnotes
Agradecimientos
Esta investigación recibió apoyo económico de COLCIENCIAS, el Instituto Pasteur y la Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB).