Abstract
A morphological and histological study was performed on the digestive system of Aegorhinus superciliosus (Coleoptera: Curculionidae), an important economic pest in southern Chile. This species has a typical digestive system for most insects, being similar in males and females, but longer in the latter, being twice the length of the insect. The digestive system is a long tube of variable diameter, divided into three regions: foregut, midgut and hindgut. From the histological point of view, it presents epithelium tissue features similar to the one described for other species, and externally it has a muscle tissue with no differences between males and females. Nevertheless, it shows features which differ either in other weevils or in beetles such as: absence of crop, the location and number of gastric caeca, presence of peritrophic membrane, and absence of a rectal pad.
Introducción
El burrito del frambueso Aegorhinus superciliosus (Guérin-Méneville, 1830) (Coleoptera: Curculionidae) es un insecto nativo del cono sur de América (Chile y Argentina), cuya larva posee poderosas mandíbulas con las cuales corta y tritura raíces y raicillas de sus hospederos, horadando finalmente la raíz principal cerca del cuello donde construye una cámara pupal, actividad larvaria que provoca un detrimento en la planta (Kuschel 1951; Carrillo 1993; Elgueta 1993; Cisternas et al. 2000). Los adultos ocasionan daños a brotes, tallos y frutos, que en ataques graves producen la muerte de la planta (Carrillo 1993).
Pese a la importancia que, desde el punto de vista productivo y económico, representa este insecto existe escasa información referente a su biología, la cual se limita principalmente a los aportes de Reyes (1993), Pérez (1994), Aguilera y Rebolledo (2001) y Parra et al. (2009). En general, las investigaciones realizadas han sido enfocadas al manejo y control de esta especie pero no existen antecedentes sobre la morfología del sistema digestivo de este curculiónido. Éste, sin embargo, es un área de contacto entre el insecto y el medio ambiente, y el foco de gran parte de los métodos de control de esta plaga (Chapman 1998).
Específicamente la región del mesenterón, presenta un gran interés, ya que las alteraciones en esa zona pueden afectar el crecimiento, desarrollo y todos los eventos fisiológicos que dependen de una adecuada alimentación, absorción y transformación de nutrientes (Mordue y Blackwell, 1993; Mordue y Nisbet 2000). Debido a que no existen antecedentes sobre morfología e histología de los sistemas vitales de este insecto, se planteó como objetivo de este estudio describir morfológica e histológicamente los órganos que comprenden el sistema digestivo, determinando su forma, tamaño y composición celular. Esta investigación aporta información descriptiva básica sobre A. superciliosus que permitirán establecer futuras estrategias de manejo y control.
Materiales y métodos
Material biológico.
Se colectaron manualmente adultos de A. superciliosus entre noviembre 2010 y enero 2011, en una plantación comercial de arándanos orgánicos, ubicada en el Fundo El Roble, sector Martínez de Rozas, Comuna de Freire, Región de La Araucanía, Chile (38°57′12″S 72°37′54″O).
Lugar del estudio.
Los insectos fueron transportados juntos en una caja de plástico transparente al laboratorio de Entomología Aplicada de la Universidad de La Frontera, Temuco, Chile, donde se alimentaron con hojas de maitén (Maytenus boaria: Celastraceae) y se mantuvieron bajo condiciones controladas de humedad (53% ± 2,3) y temperatura (26 °C ± 1,1).
Disección.
Para el estudio morfológico e histológico, se hicieron disecciones de machos y hembras aletargados en frío (-15 °C), bajo una lupa estereoscópica binocular marca LEICA MZ75. La disección se inició con el desprendimiento de las antenas, patas y cortes dorso laterales de tórax y abdomen, fracturando la cutícula hasta llegar a la cabeza y rostrum. Se retiraron los fragmentos de cutícula y de la membrana interna a la cual se encuentra adherido el segundo par de alas, para facilitar la limpieza. Los órganos internos extraídos fueron colocados sobre placas petri con agua destilada (Hosseini-naveh et al. 2007; 2009), con pinzas y tijeras de punta fina se realizó la extracción del tejido adiposo circundante para continuar separando el sistema digestivo del resto de los sistemas vitales. El sistema digestivo fue dividido en tres partes (anterior, media y posterior) y luego cada parte se midió bajo una lupa equipada con reglilla micrométrica. Los órganos del tracto digestivo fueron fotografiados con una cámara Nikon para determinar su forma y tamaño, siguiendo la metodología propuesta por Rubio y Acuña (2006).
Preparación histológica de las muestras.
Cada parte (intestino anterior, medio y posterior) fue fijada en Bouin acuoso (Baker 1969), durante 48 horas, deshidratada en alcohol y, posteriormente, incluida en paraplast con enfriamiento y solidificación a temperatura ambiente. Se obtuvieron cortes seriados de 7 µm. de espesor en un micrótomo de rotación Microm HM 335 E para luego ser teñidos con hematoxilina eosina (Uría y Mora 1996).
Resultados
Descripción morfológica.
En adultos de A. superciliosus, el sistema digestivo está constituido por un tubo de diámetro variable y longitud mayor al doble del tamaño del insecto, especialmente en las hembras (Tabla 1). Como en la mayoría de los insectos, este se encuentra dividido en tres regiones bien definidas: intestino anterior o estomodeo, intestino medio o mesenterón e intestino posterior o proctodeo. El intestino anterior ocupa en la hembra el 5%, el intestino medio el 50% y el intestino posterior el 45% de la longitud total. En el caso del macho, los respectivos porcentajes fueron 7, 50 y 43% del largo total del tubo digestivo.
Estomodeo.
Tamaño (mm) ± desviación estándar (DE) de los diferentes órganos componentes del tracto digestivo del burrito del frambueso Aegorhinus superciliosus.
Intestino anterior.
Es un tubo de poca longitud (2,15 mm en la hembra y 2,6 mm en el macho), que se inicia en la boca y termina en el cardias. Comprende la faringe, el esófago y el proventrículo (Fig. 1A). La faringe es un tubo delgado con múltiples tráqueas, que se encuentra entre la cavidad preoral y el esófago (Fig. 1A). El esófago (Figs. 1A, 1C) es un tubo corto, poco diferenciado que no presenta la zona de ensanchamiento conocida como buche y se une al proventrículo (Figs. 1B, 1C). Este último es la zona de mayor diámetro y se presenta como una dilatación definida (órgano esférico), siendo la sección más dura y esclerotizada del canal alimentario que culmina en la válvula “cardíaca” o cardias (Fig. 1B), un área de poca longitud que no permite que los alimentos regresen desde el intestino medio al intestino anterior.
Intestino medio.
Posterior al cardias, se encuentra el mesenterón, que comprende dos regiones: ventrículo anterior y posterior. El ventrículo anterior, es una porción que aparece como una diferenciada dilatación en forma de bulbo (Figs. 1C, 2A) (8,88 mm en la hembra y 8,10 mm en el macho), a su vez el ventrículo posterior (Fig. 2B) es una región larga y angosta (11,34 mm en la hembra y 10,5 mm en el macho), que se encuentra externamente tapizada por numerosos ciegos gástricos de tamaño uniforme, que culmina en una constricción denominada válvula pilórica o píloro.
Intestino posterior.
Esta porción es un tubo largo (18,30 mm en la hembra y 16,08 mm en el macho), que se inicia con la válvula pilórica de la cual nacen seis tubos de Malpighi (Fig. 3A) de gran longitud, que se encuentran rodeando todo el interior del insecto, especialmente el mesenterón y enlazados con un gran número de tráqueas. Los tubos de Malpighi se agrupan en dos: un grupo que contiene cuatro túbulos y el otro con sólo dos túbulos (Tipo II, según la clasificación de Calder 1989).
A continuación, justo después de la válvula pilórica se encuentra el íleon (Figs. 3A, 3B), que es la porción más larga del proctodeo (6,54 mm en la hembra y 6,38 mm en el macho) y presenta un diámetro uniforme en toda su estructura. Posterior al íleon se encuentra el colon (Figs. 3B, 3D), porción más corta (3,36 mm en la hembra y 2,46 mm en el macho) pero voluminosa. El recto (Figs. 3B-3D), es la última zona y presenta un área de mayor diámetro formando la ampolla rectal (Figs. 3C, 3D), la cual concluye en una pequeña porción denominada saco anal (Figs. 3C, 3D). Por último se encuentra el ano (Fig. 3D), que es la válvula encargada de evacuar los desechos del insecto al exterior y que termina en una zona más estrecha.
Mesenterón.
Proctodeo.
Descripción histológica
Intestino anterior.
Está compuesto, desde el exterior hacia el interior, por una capa de músculos circulares, seguida de una capa relativamente gruesa con músculos longitudinales que se continua en una capa de epitelio simple plano, con la presencia de tráqueas y células con núcleos centrales redondeados, con la cromatina en corpúsculos y un citoplasma acidófilo denso y esponjoso (Fig. 4A). Internamente se encuentra un epitelio simple cilíndrico, cuyas células presentan un núcleo ovoide a un mismo nivel en la región basal. Finalmente, en contacto directo con el lumen, se observa la íntima, una capa delgada, densa, amorfa y plegada hacia el interior y el epitelio muscular (Fig. 4B). El proventrículo está formado por músculos circulares que son responsables de la constricción del mismo durante el filtrado de los alimentos.
Intestino medio
Intestino anterior. A. Corte transversal donde se observa los músculos circulares (mc), los músculos longitudinales (ml), las tráqueas (t), el lúmen (1). B. Vista ampliada del intestino anterior, donde observamos los músculos circulares, el epitelio muscular (em), el epitelio simple (es) y la capa íntima (i) (40x y 100x).
(Fig. 5). Sobre el epitelio se ordenan dos capas musculares: primero externamente una de músculos circulares y otra interna de músculos longitudinales. Entre los haces musculares se acomodan las tráqueas y una membrana de tejido conectivo. Las células más características del epitelio en este insecto, son cilíndricas con microvellosidades, formando un borde estriado que delimita el lumen.
Ventrículo anterior.
La pared del mesenterón comprende dos capas de músculos estriados: externa (circular) con fibras continuas e interna (longitudinal), separadas por espacios intersticiales. Luego se continúa en un epitelio simple cilíndrico de células columnares, altas y delgadas y un núcleo ovoide, claramente visible (Fig. 5A), que está constituido por células regenerativas, con citoplasma fuertemente acidófilo y un núcleo con cromatina dispersa, cuya función sería la absorción y secreción, que descansa sobre una membrana basal delgada. En estas células epiteliales se puede observar la presencia de leves invaginaciones con microvellosidades en la zona apical. El intestino medio carece de íntima cuticular y la parte más profunda, aquella que rodea el lumen o cavidad por donde circula el alimento digerido, está formada por una delgada capa de células epiteliales denominada membrana peritrófica, altamente permeable, ya que permite el paso de la secreción gástrica que va a penetrar en la masa de los alimentos. Entre el epitelio y la membrana peritrófica encontramos un espacio constituido por tejido conectivo.
Intestino medio. A. Vista general de las células columnares del epitelio simple del ventrículo anterior (100x). B. Vista general del ventrículo posterior donde se observan los ciegos gástricos (cg), el epitelio del ventrículo (ev) y el lúmen (1) (40x). C. Vista ampliada de la estructura circular de un ciego gástrico formada por células cilíndricas (c) con su respectivo núcleo (100x). D. Vista de la abertura independiente de un ciego gástrico hacia el lumen del intestino posterior (100x).
Ventrículo posterior.
Las células características del epitelio de revestimiento de esta sección, son cilíndricas con microvellosidades, formando un borde estriado que delimita el lumen (Fig. 5B). Las microvellosidades también están presentes en el borde interno. El alimento en el interior del lumen está rodeado por la membrana peritrófica.
Ciegos gástricos.
El epitelio del ventrículo posterior se caracteriza por la presencia de ciegos gástricos, que se abren en forma independiente hacia el lúmen del intestino y se encuentran distribuidos en forma regular a través del ventrículo posterior (Fig. 5C). Muestran una pared con capas musculares similar a las del canal alimentario; sobre la capa muscular presentan una estructura circular formada por células cilíndricas, con núcleos redondos situados centralmente con el polo distal más angosto bordeando el lumen (Fig. 5D).
Intestino posterior. A. Corte transversal del ileon donde se aprecian los músculos circulares (mc), músculos longitudinales (ml), el epitelio (e), las protrusiones del citoplasma (pc) (40x). B. Vista ampliada del íleon con el epitelio (e), los músculos circulares (mc) y los músculos longitudinales (ml) (100x).
Intestino posterior
(Fig. 6). En general el intestino posterior está constituido por una pared con abundantes músculos circulares y en la superficie luminal está revestido por la capa íntima que se originaría en la región pilórica.
Ileon.
Está constituido externamente por una capa cerosa de células epiteliales planas, que protegen la pared intestinal, a continuación presenta una pared externa de músculos circulares y una capa interna de músculos longitudinales (Fig. 6A), además se observa un epitelio de revestimiento simple cilíndrico cuyo citoplasma provoca protrusiones hacia el lumen, lo cual forma vellosidades intestinales (Fig. 6B).
Intestino posterior. A. Corte transversal del colon donde se aprecian las células musculares (cm), el epitelio cilíndrico simple (ecs), pliegues invaginados (pi) (40x). B. Vista ampliada de un pliegue del íleon con células secretoras (cs), núcleos (n) y la capa íntima (i) (100x).
Colon.
Porción tubular del proctodeo que está revestido externamente por una pared de células musculares y presenta en su parte interna ondulaciones y pliegues invaginados (Fig. 7A) con presencia de vellosidades que posiblemente estén recubiertas por células secretoras de enzimas. La porción del colon que está próxima al recto no presenta vellosidades. Esto indica que, en general, el proctodeo tiene la misma estructura, con una pared cubierta por músculos, lo cual ayudaría a darle la forma y a realizar la función de esta región. El revestimiento interno de este órgano está formado por tejido epitelial simple cilíndrico (Fig. 7B) ya que las células presentan contornos rectangulares y la altura de estas es mayor que la que presentan las células del epitelio simple cúbico.
Recto.
La pared interna del recto aparece muy plegada y externamente rodeada por una capa desarrollada de músculos circulares y longitudinales que dan forma y ayudan al funcionamiento de esta región (Fig. 8A). Los longitudinales están formados por células planas, delgadas, con núcleo central, alargado, cromatina laxa, con uno o más nucléolos y citoplasma uniforme (Fig. 8B), no se aprecian almohadillas rectales que son comunes en otros insectos. Las células de estos músculos tienen capacidad contráctil, lo que permitiría que los desechos sean expulsados al exterior. Internamente entre las fibras musculares y el detritus presenta un recubrimiento, formado por un epitelio cúbico simple con células esféricas y núcleo ovoide heterocromático y citoplasma basófilo (Fig. 8C).
Intestino posterior. A. Corte transversal del recto donde se aprecian los músculos circulares (mc), los músculos longitudinales (ml), el epitelio (e), los pliegues del recto (pr) (100x). B. Vista ampliada de las fibras musculares del recto (fm) con sus células planas (cp), el epitelio (e) con células y núcleo claramente visible (n) (100x). C. Vista ampliada de la fibra muscular (fm) con células planas y núcleos claramente visibles (n) (100x).
Discusión
El sistema digestivo de A. superciliosus está constituido por un tubo, por lo general, recto o en espiral que se extiende desde la boca hasta el ano, con tres secciones principales que tienen diferentes orígenes embrionarios: el intestino anterior o estomodeo, el intestino medio o mesenterón y el intestino posterior o proctodeo, lo que concuerda con lo reportado por Borror y DeLong (1969), Belkin (1976), Snodgrass (1993), Chapman (1998) y Terra y Ferreira (2003), y similar a lo observado en otros coleópteros tales como: Dendroctonus spp. (Díaz et al. 2000, 2003; Silva-Olivares 2003), D. parallelocolli Chapuis, 1869, D. rhizophagus Thomas y Bright, 1970, D. valens Leconte, 1859, (Díaz et al. 1998), Trypodendron lineatum (Olivier, 1795), Gnathotichus retusus (Leconte, 1868), G. sulcatus (Leconte, 1868) (Schneider y Rudinsky 1969), Cosmopolites sordidus (Germar, 1824), Metamasius hemipterus (Linneaus, 1758), M. hebetatus (Gyllenhal, 1838) (Rubio y Acuña 2006), Ips pini (Say, 1826) (Hall et al. 2002), Scolytus multistriatus (Marsham, 1802) (Baker y Estrin 1974), Compsus sp. (Rubio y Acuña 2007), Rhynchophorus palmarum (Linnaeus, 1758) (Sánchez et al. 2000), Phyllophaga anxia (Leconte, 1850) (Berberet y Helms 1972), Anthonomus grandi Boheman, 1843 (MacGown y Sikorowski 1981) e Hyperia postica (Gyllenhal, 1813) (Tombes y Marganian 1967). Estas estructuras también han sido observadas en otros insectos tales como: Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1818) (Levy et al. 2004), Apis mellifera Linnaeus, 1758 (Aljedani et al. 2010), Tropidacris collaris (Stoll, 1813) (Wanderley-Teixeira et al. 2006), Nasutitermes takasagoensis (Shiraki, 1911) (Tokuda et al. 2001).
Con respecto al intestino anterior, Chapman (1998) y Terra y Ferreira (2003) indican que se encuentra subdividido en diversas partes funcionales: faringe, esófago, buche y proventrículo. En A. superciliosus encontramos las mismas partes excepto el buche, lo cual coincide con la descripción de Sánchez et al. (2000) para R. palmarum, pero difiere de lo reportado por Rubio y Acuña (2006) para C. sordidus, M. hemipterus y M. hebetatus, Rubio y Acuña (2007) para Compsus sp. y por Rubio et al. (2008) para Hypothenemus hampei (Ferrari, 1867), debido a que estos insectos presentan un buche fácilmente reconocible. Según Terra (1990), esto se debería a que en la evolución de los coleópteros, se produjo una gran reducción o pérdida del buche. Además Toro et al. (2009) explican que la porción terminal del esófago, fuertemente musculosa, llamada proventrículo no está bien diferenciada en especies de alimentación líquida (pulgas), pero en el caso de A. superciliosus, que tiene un alimento sólido, está claramente definida, lo que muestra la relación del desarrollo del proventrículo con el tipo de alimento ingerido por el insecto.
En el mesenterón de A. superciliosus, se distinguen dos regiones bien definidas: ventrículo anterior y ventrículo posterior, particularidad que está presente en otros coleópteros tal como lo señalan Wigglesworth (1974) y Crowson (1981), quienes indican además que la estructura y función del mesenterón guarda relación con el tipo de alimento ingerido. De acuerdo a lo anterior, Sánchez et al. (2000) indican que el intestino medio de R. palmarum tiene cierta similitud de forma y tamaño con A. grandis, C. sordidus, M. hemipterus y M. hebetatus ya que Macgown y Sikorowski (1981) y Rubio y Acuña (2006), señalan que en estas especies la porción anterior del mesenterón aparece como una diferenciada dilatación en forma de bulbo ovoide y la porción posterior es un tubo delgado, de menor diámetro, lo cual coincide con lo encontrado en A. superciliosus.
El ventrículo anterior presenta un epitelio columnar similar al encontrado en P. anxia (Berberet y Helms 1972), R. palmarum (Sánchez et al. 2000) y T. collaris (Wanderley-Teixeira et al. 2006). Además presenta un borde interno cubierto por microvellosidades, descritas por Snodgrass (1993) y Chapman (1998) para insectos en general. Macgown y Sikorowski (1981), reportaron que en A. grandis el ventrículo posterior se encuentra revestido externamente por ciegos gástricos, los cuales contienen bacterias y otros microorganismos del tubo digestivo que producen enzimas y vitaminas. En este caso A. superciliosus tiene cierta similitud con A. grandis y Dendroctonus frontalis Zimmerman, 1868 (Díaz et al. 2000), ya que estos autores señalan que varios ciegos gástricos se identificaron en la porción terminal del ventrículo posterior, lo que coincide con nuestros resultados, caso contrario a lo observado en R. palmarum pues según Sánchez et al. (2000) estos serían dos y se encontrarían en el ventrículo anterior. Además Rubio y Acuña (2006) observaron que los ciegos gástricos de C. sordidus, M. hemipterus y M. hebetatus, se encontraban tanto en el ventrículo anterior como posterior lo cual difiere de nuestros resultados y los reportes de otros autores. Internamente los ciegos gástricos presentan una pared con capas musculares similar a las del canal alimentario y poseen una estructura circular, formada por células cilíndricas lo cual concuerda con lo expuesto por Sánchez et al. (2000) para R. palmarum.
Toro et al. (2009) explican que en especies que ingieren tejidos, el epitelio parece estar protegido por una secreción celular que formaría la membrana peritrófica (PM) que reemplazaría de cierto modo la función protectora del mucus secretado en los animales por las células caliciformes. Al respecto Terra et al. (2006) y Bolognesi et al. (2008) explican, que es una estructura anatómica que rodea el bolo alimenticio en coleópteros y en la mayoría de los insectos. En el caso de A. superciliosus, el intestino medio está recubierto por esta membrana, lo cual según Crowson (1981), estaría relacionada con la ingesta de alimentos, ya que sólo los coleópteros que consumen alimentos con alto contenido de sólidos presentarían dicha membrana. Nuestros resultados coinciden con los reportados por Vásquez-Arista et al. (2001) para Prostephanus truncatus (Horn 1878), pero difieren de los reportados por Sánchez et al. (2000) para R. palmarum, Berberet y Helms (1972) para P. anxia, y Chadbourne (1961) para A. grandis ya que en estos insectos no se encuentra presente dicha membrana.
El mesenterón, se encuentra separado del proctodeo por la válvula pilórica o píloro desde la cual nacen seis tubos de Malpighi, largos, uniformes en todo su recorrido y se disponen enlazados sobre el tubo digestivo. Lo anterior coincide con lo informado para R. palmarum (Sánchez et al. 2000), C. sordidus, M. hemipterus y M. hebetatus (Rubio y Acuña, 2006), Compsus sp. (Rubio y Acuña, 2007), H. hampei (Rubio et al. 2008). Además con lo reportado por Wigglesworth (1974), Crowson (1981), Calder (1989) y Snodgrass (1993) quienes han registrado entre cuatro y seis tubos de Malpighi en otros coleópteros.
El proctodeo es un tubo largo, pero de menor diámetro que presenta ondulaciones y pliegues invaginados, constituido por una pared rodeada por una capa de músculos circulares y longitudinales que dan forma y participan en el funcionamiento de esta región. Estas observaciones son similares a las descritas por Berberet y Helms (1972) para P. anxia y Crowson (1981) para coleópteros en general. Además está formado por el ileon, un tubo largo y delgado, similar al descrito para Dendroctonus adjuntus Blandford, 1897 (Zuñiga et al. 1994), pero diferente al encontrado en otros coleópteros, donde se describe como corto o bien como un órgano indiferenciado (Chapman 1998). El colon, está revestido externamente por una pared de células musculares y presenta en su parte interna ondulaciones y pliegues invaginados con presencia de vellosidades lo cual concuerda con lo reportado para R. palmarum (Sánchez et al. 2000). La porción del colon que está próxima al recto no presenta vellosidades. Esto indica que en general el proctodeo tiene la misma estructura, con una pared cubierta por músculos, lo cual ayudaría a darle la forma y a realizar la función de esta región. El recto es la última sección del intestino posterior y es un saco amplio y de paredes delgadas (ampolla rectal) que tiene un epitelio cilíndrico que está revestido por células musculares con capacidad contráctil, no presentando almohadillas rectales. Snodgrass (1993) explica que en algunos coleópteros estos órganos estarían ausentes, difiriendo de lo reportado por Zuñiga et al. (1994) para D. adjuntus. Finalmente, se encuentra el ano, tubo corto adosado al sistema reproductor, lo cual coincide con lo reportado para otros coleópteros (Wigglesworth 1974; Crowson 1981; Sánchez et al. 2000; Rubio y Acuña 2006).
Conclusión
Se describe por primera vez la morfología e histología del tubo digestivo del burrito del frambueso Aegorhinus superciliosus. Los resultados indican que presenta la misma división y estructuras típicas descritas para la mayoría de los insectos y para otros coleópteros de la misma familia. Sin embargo existen diferencias como: ausencia de buche, número y posición de los ciegos gástricos, presencia de membrana peritrófica y ausencia de almohadillas rectales. De acuerdo a los antecedentes presentados y debido a que no existen estudios de la anatomía interna e histología de A. superciliosus, se considera que esta investigación representa un aporte para el conocimiento de aspectos básicos de este insecto en nuestro país y puede establecer futuras estrategias de manejo y control de esta importante plaga del arándano.
Footnotes
Agradecimientos
Al Dr. Ramón Rebolledo, al equipo de trabajo del Laboratorio de Histología de la Facultad de Medicina de la Universidad de La Frontera, al proyecto DI12- 0026 DIUDRO y a CONICYT por la beca de post grado, la cual ha permitido realizar esta maravillosa investigación.