Preservación Y Almacenamiento de Adn de Mariposas Utilizando Papel Filtro

Abstract

Two techniques for butterfly DNA storage were compared using Polymerase Chain Reaction (PCR) amplification of a fragment from the ND4 gene. Extracted DNA was put into microcentrifuge tubes and stored at -20°C; alternatively, they were put on filter paper and stored at ambient temperatures. Fragments of DNA amplified through PCR that came from filter paper exhibited high quality. Our results suggest storage on filter paper to be a simple, effective and inexpensive alternative to preserve extracted DNA.

Los estudios moleculares en mariposas han proporcionado un renacimiento en la sistemática de este grupo que constituye uno de los más grandes y diversos del mundo animal. Al interior de Insecta, el orden Lepidoptera (mariposas y polillas) constituye el segundo orden más rico en número de especies, con cerca de 170.000 especies reconocidas y unas 300.000 especies todavía sin describir (Wahlberg 2006). Con base en dichos estudios, se han abordado aspectos taxonómicos, biogeográficos y evolutivos proporcionando avances significativos en el conocimiento sobre estos organismos (Sperling 2003; Sperling y Harrison 1994; Mallarino et al. 2005; Whinnett et al. 2005).

En la actualidad técnicas como la obtención de secuencias nucleotídicas y otras basadas en la PCR (por su nombre en inglés Polimerase Chain Reaction), son de uso común en los estudios de sistemática molecular de mariposas y constituyen una de las principales herramientas para complementar y contrastar la información obtenida con base en caracteres morfológicos (Campbell y Pierce 2003; Keyghobadi et al. 2003). Para los entomólogos y en este caso particular para aquellos interesados en estudios moleculares de mariposas, el intercambio de muestras (especímenes o ADN) así como la calidad y cantidad de ADN obtenido son de gran importancia; por lo tanto, aspectos como el almacenamiento, trasporte y posible degradación de las muestras por los ciclos repetidos de congelación y descongelación deben recibir especial consideración. Todos ellos, determinan en gran parte la calidad de la información obtenida (Hoy 1994; Avise 2004; Dessauer et al. 1996).

Por lo general, las extracciones de ADN realizadas a partir de insectos son almacenadas de forma individual en tubos de microcentrífuga y congeladas a -20°C o -80°C hasta su utilización en las diferentes técnicas moleculares; también pueden peletizarse mediante precipitación en alcohol o secarse al vacío cuando se almacenan por largos periodos. En este último caso, se requiere la resuspensión del ADN en el momento de realizar la técnica de amplificación (PCR) (Yang et al. 1997).

El papel filtro es usado de rutina en procedimientos de laboratorio y se ha implementado con éxito en extracciones de ADN. Así, la técnica conocida como Flinders Technology Associates (FTA®) permite la extracción del ADN a partir de sangre y su preservación a temperatura ambiente. En ella, se utiliza el papel filtro como una matriz de almacenamiento del ADN siendo una solución adecuada para aislarlo y preservarlo. Aunque esta técnica se ha realizado con algún éxito en plantas y pequeños insectos, es demasiado costosa en relación con la lisis celular tradicional en la que se basa la mayoría de los métodos de extracción de ADN en insectos (1 dólar vs 0.05 dólares por muestra). (Devost y Choy 2000; Natarajan et al. 2000; Snowden et al. 2002). En la presente nota se presenta una forma sencilla, económica y efectiva para almacenar, preservar e intercambiar ADN de mariposas utilizando papel filtro. Vía PCR se comparó la utilización del papel filtro comercial con la congelación y almacenamiento en tubos de microcentrífuga a -20°C de las muestras.

Materiales y Métodos

Las mariposas utilizadas fueron Oleria fumata (Haensch, 1905) y Oleria makrena (Hewitson, 1854) colectadas en el municipio de Jardín, Antioquia. Las extracciones de ADN individuales se realizaron a partir de dos patas de las mariposas congeladas a -20°C entre dos a cinco meses de su recolección. La extracción se realizó mediante el método sugerido en el kit comercial Dneasy kit (QIAGEN).

El ADN extraído de 50 muestras fue resuspendido en 80 ul, de TE. La calidad de las muestras se verificó mediante observación en geles de agarosa al 0,8%. Las muestras con PCR positivo para el gen ND4 (subunidad 4 de la NADH- deshidrogenasa-mitocondrial-) se seleccionaron para la comparación. Posteriormente, se dispuso de dos trozos circulares de 3 cm de diámetro de papel filtro No.1 de advantec MFS, inc. marcados con lápiz para cada muestra. Con una micropipeta Gilson se depositaron sobre cada círculo 25 µl, de ADN y se dejaron secar durante 10 horas. Para ello, los círculos se colocaron sobre cajas de petri estériles con doble papel servilleta encima y debajo. Una vez secos, se retiraron de las cajas petri y se depositaron en sobres blancos de papel respectivamente marcados que se almacenaron a temperatura ambiente (25°C) en un cajón de madera de 20 x 20 cms. Otros 25 µl, de cada muestra se almacenó a -20°C en tubos de microcentrífuga.

Cada mes durante cuatro meses tanto las muestras congeladas como las almacenadas en papel filtro, se probaron para PCR utilizando los cebadores ND4ar 5'-AA(A/ G)GCTCATGTTGAAGC-3' y ND4c 5'-ATTTAAAGG(T/ C)AATCAATGTAA-3', diseñados por Uribe et al. (2001) en el CDC de Atlanta, que amplifican un fragmento del gen ND4 de aproximadamente 600pb. La PCR se desarrolló con el siguiente perfil térmico: 94°C durante tres minutos, 35 ciclos a 93°C, durante 30 segundos, 48°C durante un minuto, 70°C durante un minuto y un paso final de extensión de 72°C durante 10 minutos. Los geles se visualizaron y fotografiaron en un transiluminador con luz ultravioleta (Biodoc analyzer, Biometra).

Para ambos tratamientos el volumen de la reacción fue de 50 µl empleando 2 ul de ADN molde en el caso del ADN congelado y un circulo de papel de 4mm, retirado con un sacabocado de las muestras almacenadas a temperatura ambiente (aprox. 25°C) y depositado en la mezcla de reacción. Los reactivos de mezcla de reacción, (Fermentas) se utilizaron en las siguientes cantidades y concentraciones: 5 µl de buffer 10x, 4 µl de MgCl2 (25 mM), 0,1 µl de dNTPs (1mM), 0,3 µl de taq polimerasa (500U) y 0,3 µl de cada primer (50 µM) y agua ultrapura estéril ajustada al volumen final de la reacción. Las muestras se clasificaron como positivas o negativas para PCR.

Resultados

De las 50 extracciones, 48 fueron positivas para PCR con los cebadores para amplificar el fragmento del gen ND4 las cuales se seleccionaron para la comparación. Al realizar de nuevo los PCR después de preservar las muestras congeladas y en papel filtro, se obtuvieron resultados positivos en cada uno de los cuatro meses para la totalidad de las muestras. En la figura 1 se observan algunos de los amplificados para algunas de las mariposas.

Los resultados verifican que el ADN almacenado a temperatura ambiente en papel filtro durante cuatro meses funcionó de forma efectiva para el almacenamiento y preservación del ADN genómico verificado por la técnica de PCR. Esta técnica representa una excelente fuente de almacenamiento de ADN sin los costos de congelación y con gran economía de espacio, ya que un gran número de muestras podrían almacenarse en sobres de papel en gabinetes de madera a temperatura ambiente. Otra ventaja es el fácil intercambio de las muestras entre investigadores al poder enviar los discos de papel en vez del ADN en solución lo cual significa no solo bajar los costos, sino también los riesgos de pérdida de la muestra por derrames o fracturas en los tubos. Esta forma de envío también es útil para remitir las muestras a laboratorios nacionales o internacionales para análisis o secuenciación. Adicionalmente, se evitan los ciclos de congelación y descongelación que afectan la calidad del ADN y se optimiza la cantidad de reacciones de la PCR que pueden realizarse con base en una muestra, la cual corresponde al número de círculos que pueden usarse para cada reacción.

Es importante validar este estudio con un número mayor de muestras y por diferentes tiempos de almacenamiento del ADN ya que existe cierto grado de degradación del ácido nucleico, el cual puede ser más evidente con el paso del tiempo. Esta forma de conservar y preservar el ADN puede ser de gran utilidad en especial para técnicas como la PCR en la cual se logran resultados exitosos con pequeñas cantidades de ADN y aun con cierta degradación. Esto es especialmente válido para ADN mitocondrial uno de los más utilizados en la actualidad para estudios evolutivos y biogeográficos (Quicke 1993; Avise 2004; Hoy 1994).

Figura 1.

Amplificados del gen ND4 para ejemplares de O. fumata y O. makrena. Las muestras del gel A fueron congeladas a -20°C. Las muestras del gel B fueron conservadas en papel filtro. En los carriles número 2-3, 6-7, 10-11, 14-15 se sembraron muestras de O. fumata. En los carriles 4-5, 8-9, 12-13, 16-17 se sembraron muestras de O. makrena. El carril número 1 corresponde al marcador de peso molecular (100 pb).