Abstract
The South American fruit fly Anastrepha fraterculus (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a quarantine pest of pineapple guava. Artificially infested fruits were subjected to cold treatment “t107a” (1.1° C for 15 d), required by USDA-APHIS for exportation and were compared to control fruits maintained at room temperature. Four third-instar larvae were infested per individual fruit in two treatments with 50 replicates. Body length, volume, behavior, mortality and color changes of the larvae were recorded daily in a sample of three fruits. The first behavioral change observed in larvae under cold quarantine treatment was an attempt to abandon the fruits. No variation in body length or volume was observed under the cold quarantine treatment. In the untreated control, larvae increased body volume up to the final molt to pupa. The cold quarantine treatment affected larval development and the larva-pupa molt. All larvae died on the eighth day of cold treatment. Most larvae died while molting to pupa and exhibited a dark coloration or “partial molt”. Under the cold quarantine treatment, damage to fruits did not exceed 24% where as in the untreated control it reached 74%. This is the first cold quarantine treatment tested for this pest of pineapple guavas in Colombia and it provided total control. Compliance with the quarantine requirements of USDA-APHIS opens the international market for Colombian exporters of pineapple guava.
Keywords
Introducción
La feijoa, Acca sellowiana (O. Berg) Burret, es una especie frutícola que por sus características organolépticas y nutricionales tiene buena aceptación en los mercados nacionales e internaciona-les. En Colombia, se ha aumentado el área de cultivo de la feijoa en los últimos 10 años, como una alternativa viable para la diversificación de la producción agrícola (Corporación Colombia Internacional 2000). Entre las plagas limitantes de este cultivo se encuentran las moscas de la fruta, que incluyen especies de gran im-portancia económica, no solo por oca-sionar daño directo a la fruta sino también por las restricciones cuarentenarias que implican para el comercio internacional (Benavides y Mora 2003). La exporta-ción de feijoa desde Colombia se ve afec-tada por la presencia de Anastrepha fraterculus (Wiedemann), Anastrepha spp. y Ceratitis capitata (Wiedemann) Diptera: Tephritidae (Flórez 2003). Las moscas de la fruta son la mayor plaga hortifrutícola y probablemente el princi-pal grupo de plagas cuarentenarias en el mundo (Hallman 1997). Los riesgos de extender estas plagas hacia otros países, y el creciente volumen de productos que se exportan en fresco, hacen necesario el estudio de los riesgos y medidas de mitigación que se podrían emplear para facilitar el comercio. Para prevenir la intro-ducción inadvertida de especies de mosca de la fruta, las frutas a exportar son some-tidas a tratamientos cuarentenarios, trans-portadas desde áreas certificadas como libres de la plaga o empacadas bajo siste-mas que reducen el riesgo de infestación a niveles despreciables (Sharp y Hallman 1994). Los tratamientos cuarentenarios no químicos, propuestos por el departa-mento de agricultura de los Estados Uni-dos (USDA, APHIS), proporcionan una oportunidad a países que buscan partici-par en el mercado de este país. Sin em-bargo, es importante que el tratamiento cuarentenario elimine las plagas y que a la vez no afecte la calidad del producto (Hallman 1991). El tratamiento cuaren-tenario en frío “t 107 a” que exige USDA, APHIS para el control de A. fraterculus, consiste en almacenar la fruta a baja tem-peratura por un largo periodo de tiempo. Las opciones de tiempo y temperatura son: igual o por debajo de 33° F (0,56° C) durante 13 días; 34° F (1,11° C) durante 15 días y 35° F (1,67° C) durante 17 días (USDA 2002).
En este trabajo se analizó el efecto del tratamiento cuarentenario en frío “t 107 a” de USDA, APHIS, simulando condicio-nes de transporte y comercialización, sobre la mortalidad y parámetros de crecimien-to de las larvas de A. fraterculus en frutos de feijoa infestados artificialmente.
Materiales y métodos
Áreas infestadas y niveles naturales de infestación
Se efectuó un muestreo general (Minis-terio de Agricultura 2000) para determi-nar las localidades más cultivadas con feijoa y con mayor incidencia de moscas de la fruta en los departamentos de Cundinamarca y Boyacá. Con base en esto, se seleccionaron tres localidades para realizar un muestreo dirigido en cada una y determinar los niveles de infesta-ción natural e identificar la especie pre-dominante de mosca de la fruta. En cada localidad se tomaron 350 frutos al azar (total 1050 frutos) en cultivos que pre-sentaran alguna sintomatología externa de daño por mosca de la fruta. Algunos frutos se recogieron del suelo (70%) y otros se tomaron directamente de los ár-boles (30%). De acuerdo con la metodo-logía establecida por Benavides y Mora (2003) los frutos se disectaron y se contó el total de larvas por fruta. Para la deter-minación taxonómica se llevaron al laboratorio de entomología de la Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Agronomía 100 frutos infestados de cada localidad para establecer una colonia de la cual se obtuvieron adultos. Se utilizó la clave de Korytkowsky (1997) y la con-firmación posterior la realizó Francisco González del Centro de Excelencia Fitosanitaria del ICA, IICA y USDA, APHIS (CEF, Bogotá, Colombia).
Tratamiento cuarentenario
El tratamiento cuarentenario en frío se realizó en el laboratorio de Entomología de la Facultad de Agronomía de la Uni-versidad Nacional de Colombia, en Bo-gotá, D. C. Se utilizaron cámaras de frío Estefano® Ltda. (Bogotá, Colombia). La temperatura y humedad relativa se ajus-taron a 1,0 ± 0,54° C y 92 ± 3,2% respec-tivamente. El registro de la temperatura se llevó a cabo usando registradores automáticos ‘testo term 175-T1®’ (Frank-furt, Alemania) de un canal de tempera-tura con sensor interno modelo 0563 1754. Para registrar la temperatura inter-na de los frutos se usó una sonda para alimentos ‘testo IP-65®` de 12 cm (-60 a 400°C), modelo 0602 2292 la cual se in-sertó en los frutos. Los sensores de tem-peratura y humedad relativa se ubicaron en los tercios superior, medio y bajo de la cámara de frío. El sensor con la sonda para registro de datos se mantuvo en el tercio central. Los sensores se programa-ron para almacenar un registro cada 15 minutos durante los 15 días de duración del tratamiento cuarentenario. Los sensores de temperatura fueron calibra-dos previamente en recipientes limpios con hielo y agua (70 y 30% respectiva-mente) de acuerdo al procedimiento es-tablecido por USDA, APHIS (USDA 2002).
Para la infestación artificial de los frutos se utilizaron larvas de tercer instar pro-venientes de una cría del Laboratorio de Cuarentena Vegetal del Instituto Colom-biano Agropecuario (ICA) en Ibagué (Tolima) alimentadas en dieta artificial compuesta por torula, benzoato de sodio, agar nutritivo, ácido clorhídrico y agua. Se utilizaron frutos de feijoa del cultivar ‘CENAF 41’, que se caracteriza por alto rendimiento y excelente aceptación por el consumidor debido a sus característi-cas organolépticas (Valderrama 2004). Las frutas fueron seleccionadas y clasifi-cadas con calidad tipo exportación.
De acuerdo con la metodología de Vidal y Abello (1998) se efectuó un corte trans-versal en la parte superior de cada fruto en forma de “copa” sin separar las dos partes y se retiró aproximadamente un 5% de pulpa para introducir las larvas. Cada larva de tercer instar se lavó con agua destilada para retirar los residuos de die-ta de su cuerpo, con un pincel se coloca-ron cuatro larvas en la cavidad formada en el fruto y se selló con cinta de enmas-carar. Para garantizar que la temperatura se mantuviese dentro de los niveles exi-gidos al interior de los frutos, se empaca-ron tres unidades en recipientes de icopor de 16 onzas y se sellaron. Los recipien-tes con los frutos ubicados en bandejas, se introdujeron en las cámaras de frío para un pre-enfriamiento durante 12 h a 4º C la cual se disminuyó gradualmente hasta que se estabilizó en 1,0° C. Al final de este periodo de pre-enfriamiento se ini-ció el tratamiento cuarentenario propia-mente dicho. Luego de los 15 días exigidos por el protocolo del tratamien-to cuarentenario, se descargaron los re-gistros de los sensores y se almacenaron en el computador para procesamiento.
Se establecieron dos tratamientos, frutos de feijoa ‘CENAF 41’ sometidos a frío (1,1° C o por debajo) y frutos del mismo cultivar almacenados a temperatura ambiente (19,0 ± 0,8°C) con 50 repeti-ciones por tratamiento en un diseño completamente al azar. Las evaluaciones del desarrollo de las larvas y su mortali-dad se realizaron cada 24 h retirando tres frutos por tratamiento de las cámaras de frío; se midió longitud, volumen corpo-ral, cambios de coloración y se cuantifi-có su mortalidad.
Desarrollo de larvas de A. fraterculus durante el tratamiento cuarentenario
Diariamente se retiraron tres frutos de las cámaras de frío, se abrieron y se observó el desarrollo general de las larvas y el daño a la pulpa de la fruta. Se utilizó una escala visual de 0 a 5 con incrementos de 20% de daño por unidad, donde 5 es el 100% de pulpa dañada. Los datos de las 12 observaciones diarias se sometieron a análisis de regresión utilizando el paque-te estadístico de Microsoft Excel® ver-sión 2003.
Longitud corporal de larvas
Cada 24 h se tomaron 12 larvas de la cá-mara de frío y se midieron desde el extre-mo de los ganchos mandibulares hasta el final del último segmento abdominal (Vélez 1985; Ministerio de agricultura 2000) se utilizó un calibrador digital Stainlees Hardened® (0,150 mm ± 0,02 mm). Para establecer si el tratamiento cuarentenario afectaba la longitud, se estableció un patrón de longitud de lar-vas de tercer instar midiendo una muestra de 400 larvas vivas de A. fraterculus provenientes de la colonia. Los datos de longitud de larvas en el tratamiento en frío y el control se compararon utilizan-do la prueba de Chi cuadrado con el pa-quete estadístico de Microsoft Excel® versión 2003.
Volumen corporal de larvas
Diariamente se retiraron 12 larvas de las frutas de cada tratamiento, se midió el radio del último segmento abdominal y la longitud de cada larva, como se des-cribió antes. Debido a que la morfología de las larvas se asemeja a un cono (Vélez 1985; Núñez 1988; Ministerio de agri-cultura 2000) para el cálculo se utilizó la siguiente ecuación (1)
Donde: V = Volumen corporal, r = radio del último segmento abdominal y, h = longitud de la larva. Los datos de las 12 observaciones diarias se sometieron a análisis de regresión utilizando el paque-te estadístico de Microsoft Excel® ver-sión 2003.
Mortalidad de larvas sometidas al tratamiento cuarentenario
Se tomó una muestra diaria de tres frutos de cada tratamiento y se contó el número de larvas vivas y muertas, para el control se contaron las larvas que mudaron a pupa y para efectos del análisis se consi-deraron “muertas” debido a que no reali-zaron mas daño a la pulpa y abandonaron el fruto. Los datos de porcentaje de mor-talidad se sometieron a análisis de regre-sión utilizando el paquete estadístico de Microsoft Excel® versión 2003.
Coloración de larvas
Para establecer si el tratamiento cuaren-tenario afecta la coloración de las larvas como ha sido registrado en la literatura por Hallman y Zhang (1997), diariamen-te se registró el color de cada una de las larvas que se retiraron para las medicio-nes y se comparó contra la tabla de color de la Royal Horticultural Society (RHS) de Londres (2001) que mide los colores en una escala numérica de claridad-oscu-ridad y una escala de letras para intensi-dad de color.
Resultados y Discusión
Áreas infestadas y niveles naturales de infestación
La mayor incidencia de especies de mos-ca de la fruta se encontró en los munici-pios de Tibasosa (Boyacá) (Ubicado a 7° 03’ de latitud Norte y 71° 57’ de longitud occidente y 2538 m.s.n.m), La Vega (ubi-cado a 3° 42′ de latitud Norte y 74° 54′ de longitud occidente y 1230 m.s.n.m) y San Francisco (Cundinamarca) (ubicado a 3° 39′ de latitud Norte y 74° 49′ de lon-gitud occidente y 1190 m.s.n.m). Se en-contró un nivel de infestación natural entre 3 y 5 larvas por fruto en los tres estadios, que corresponde a un promedio de 4.0 ± 1,6 larvas por fruto. Los frutos tomados del suelo presentaron mayor in-festación que los frutos obtenidos direc-tamente de los árboles. De acuerdo con el Ministerio de Agricultura (2000) cuan-do las hembras buscan el sustrato para ovipositar prefieren frutos que estén en-tre el 60 y 70% de madurez. Los frutos al caer del árbol aumentan su metabolismo y la producción de volátiles (Galvis 2003) lo que probablemente los hace más atractivos para la oviposición de las hem-bras. Actualmente, en la literatura no se encuentran registros de niveles de infes-tación de moscas de la fruta en feijoa en Colombia, por lo cual los datos mencio-nados constituyen una aproximación a los niveles naturales de infestación y obviamente, son necesarios muestreos mas detallados en otras áreas de produc-ción de feijoa en el país.
La especie predominante en los tres mu-nicipios fue A. fraterculus; sin embargo, se encontraron en menor porcentaje A. striata y A ornata (Fig. 1). El genero Anastrepha está ampliamente distribuido en cultivos de feijoa (Flórez 2003) parti-cularmente en las áreas de clima frío-mo-derado donde se cultivan varias especies de frutales. Las especies encontradas co-rresponden a las que registraron Benavides y Mora (2003) para este cultivo.
Porcentaje de infestación por especies de mosca de la fruta en las localidades de Tibasosa (Boyacá), La Vega y San francisco (Cundinamarca).
Tratamiento cuarentenario
La temperatura registrada durante el trata-miento cuarentenario en ningún caso ex-cedió la temperatura permitida (1,1° C) el valor máximo fue 1,0°C, el mínimo de 0,48°C y se obtuvo un promedio de 0,8°C; dentro de los rangos exigidos por APHIS para el tratamiento cuarentenario “t 107a”. De acuerdo con las exigencias de USDA, APHIS un solo registro superior a la tem-peratura máxima permitida es suficiente para invalidar el tratamiento cuarentenario y no permitir la entrada de un contenedor de fruta a suelo norteamericano.
Desarrollo de larvas de A. fraterculus durante el tratamiento cuarentenario
La primera reacción aparente de las lar-vas sometidas al tratamiento cuarente-nario fue abandonar el fruto. Un 50% de las larvas refrigeradas dentro de las frutas a 1,1°C durante los primeros tres días se desplazaron y perforaron la corteza del fruto intentando salir. Confrontando lo mencionado por Núñez (1988) las larvas habitualmente migran hacia el interior del fruto; en este caso, el desplazamiento hacia la corteza podría indicar una res-puesta al estrés causado por la baja tem-peratura. Existen diferencias en el porcentaje de pulpa dañada en los frutos entre los dos tratamientos (Fig. 2). El por-centaje de daño ocasionado por larvas de A. fraterculus sometidas al tratamien-to cuarentenario aumentó levemente a través del tiempo (15 días), llegando a un máximo del 24%. El porcentaje de daño está muy relacionado con el tiempo y el efecto de la temperatura del trata-miento cuarentenario, produciendo una disminución en el consumo de pulpa. Se presume que las larvas de tercer instar sufren cambios en su comportamiento al ser removidas de la dieta (Hallman 1996) según lo observado, las larvas en frutas sometidas al tratamiento cuarentenario presentaron una menor capacidad de da-ñar a la pulpa posiblemente por efecto de la baja temperatura.
Porcentaje de daño ocasionado por larvas de tercer instar de A. fraterculus, infes-tadas artificialmente en frutos de feijoa cv. ‘CENAF 41’ y sometidas al tratamiento cuarentenario “t 107 a” (1,1°C) y en el control (frutos almacenados a 19°C). Los datos presentados corres-ponden al promedio (± 0,3 a 1,1° C_y ± 0,7 a 19° C) de 12 observaciones por día.
A 19,0°C las larvas continuaron alimen-tándose y causando daño a una tasa ma-yor durante el almacenamiento. En las frutas del control las larvas produjeron daño visible a partir del segundo día de almacenamiento, y lo incrementaron a una tasa mayor que las del tratamiento cuarentenario (Fig. 2) llegando a un máxi-mo del 94% a los 12 días de almacena-miento. Sin embargo, es frecuente la contaminación con agentes patógenos que pueden afectar las condiciones para el de-sarrollo normal de las larvas por lo cual se observa cierta mortalidad en el testigo, que en buena proporción puede deberse a las condiciones experimentales.
La disminución de la actividad de las lar-vas que no abandonaron el fruto durante el tratamiento cuarentenario es una ven-taja para la comercialización de la fruta, debido a que estas no presentan daños superiores al 24% durante la comercia-lización. Cabe resaltar que el porcentaje de daño presentado como pulpa descom-puesta, está influenciado por las heridas hechas a los frutos durante la infestación artificial, lo que significaría que al some-ter frutos infestados naturalmente al tra-tamiento cuarentenario, en condiciones comerciales el daño ocasionado por la larva seria insignificante.
Longitud corporal de las larvas
La longitud de las larvas sometidas al tra-tamiento cuarentenario fue igual a la ob-tenida para el patrón de referencia (Tabla 1). De acuerdo con las evaluaciones és-tas no modificaron su tamaño, tampoco se encontró ninguna evidencia de enco-gimiento, ni elongación durante el trata-miento descartando el efecto de la baja temperatura sobre la longitud en las lar-vas con respecto al patrón. Las larvas del control tampoco mostraron cambios en su longitud, sin embargo ocurrieron al-gunos en su volumen corporal.
Longitud corporal de larvas de tercer instar de A. fraterculus durante los 15 días de tratamiento cuarentenario (1,1°C) y el control (19°C) comparado con un patrón (400 larvas de tercer instar obtenidas de la colonia). Los datos son promedios de 12 observaciones diarias de cada tratamiento.
Volumen corporal de las larvas
El volumen promedio de las larvas que se sometieron al tratamiento cuaren-tenario fue de 5,7 ± 0,1 mm³ y éste se mantuvo relativamente constante duran-te los 15 días de tratamiento (Fig. 3). Las larvas del control (19,0°C) incrementaron su volumen corporal especialmente a par-tir de los días 10 y 11 hasta llegar a 9,5 mm³ en el día 12. Esto probablemente se deba al crecimiento normal de la larva y a los procesos de muda al estado de pupa. La duración de los estados larvales de las moscas de la fruta y sus tasas de desa-rrollo dependen principalmente de la fru-ta hospedante (Benavides y Mora 2003) y la temperatura (Núñez 1981; Benavides y Mora 2003).
Volumen corporal de larvas de A. fraterculus infestadas artificialmente en frutos de feijoa cv. ‘CENAF 41’ sometidas al trata-miento cuarentenario “t 107 a” (1,1°C) y en el control (Frutos almace-nados a 19°C.). Los datos presentados corresponden al promedio (+ 0,4 a 1,1°C y ± 1,0 a 19°C) de 12 observaciones por día.
Mortalidad de las larvas sometidas al tratamiento cuarentenario
Las larvas sometidas al tratamiento cuarentenario comenzaron a morir partir del tercer día (Fig. 4). El 100% de la mor-talidad se presentó ocho días después de iniciar el tratamiento cuarentenario. Apa-rentemente las larvas trataron de mudar al estado de pupa pero no lo lograron, posiblemente por efecto de la temperatu-ra. Cabe resaltar que a medida que au-menta la madurez del fruto el porcentaje de ácido cítrico disminuye y el pH aumenta (Valderrama 2004) lo que tam-bién puede tener un efecto sobre el meta-bolismo larval. En los tratamientos cuarentenarios propuestos por USDA, APHIS se exigen almacenamientos por largos periodos de tiempo a bajas tempe-raturas. El tratamiento “t 107-a” para el control de A. fraterculus debe durar 15 días, en este caso se presentó la mortali-dad como ya se mencionó el día ocho. Cabría la posibilidad de disminuir el tiem-po del tratamiento cuarentenario, lo cual seria una opción interesante para los exportadores debido a que al disminuir el tiempo del tratamiento, se reducirían los riesgos por pérdidas de calidad en las frutas y el costo de la comercialización. Para esto es necesario realizar más inves-tigación para ajustar el tiempo de este tratamiento cuarentenario.
Porcentaje de Mortalidad de larvas infestadas artificialmente, en frutos de feijoa cultivar ‘CENAF 41’ sometidas al tratamiento cuarentenario “t 107 a” (1,1°C) y en el control (frutos almacenados a 19°C). Los datos corresponden al promedio de 12 observaciones por día durante todo el periodo exigido de tratamiento en frío.
Las larvas del control (19,0° C) sobrevi-vieron hasta el día 11 (Fig. 4) el 50% de éstas continuaron su desarrollo hacia el estado pupal y prosiguieron su ciclo de vida. El otro 50% de las larvas no sobre-vivió debido posiblemente a la contami-nación microbiana de la fruta lo cual probablemente no proporcionó un sustra-to alimenticio adecuado para el desarro-llo larval.
Coloración de larvas
Se observó un cambio gradual de colora-ción en las larvas durante el tratamiento cuarentenario. Se lograron separar 16 co-lores diferentes (Fig. 5) de acuerdo con la tabla de la Royal Horticultural Society (RHS) que correspondieron a colores cla-ros 158 y colores más oscuros 199, los colores intensos A y los colores tenues D. El cambio de coloración en las larvas so-metidas al tratamiento cuarentenario co-menzó a notarse a partir del tercer día, comenzando en la zona anterior del cuer-po. En el séptimo día se presentaron puntos oscuros en el segundo y tercer seg-mentos abdominales. En el día octavo las larvas mostraron un oscurecimiento que comenzó desde la parte posterior hasta la mitad del cuerpo. Lee (1991) se refirió a este tipo de mortalidad como “daño indi-recto por frío” probablemente debido a la falta de recursos alimenticios para las cé-lulas. Mecanismos postulados para el cho-que de frío incluyen la ruptura de las porciones de lípidos en la pared celular a temperaturas entre 1 y 2°C lo que hace que el contenido celular escape (Gould y Hennessey 1997). Larvas de tercer instar de A. ludens sometidas un tratamiento cuarentenario de pulsos eléctricos presen-taron una mortalidad similar a la obtenida en este experimento. Hallman y Zhang (1997) las llamaron “puparios larvi-formes”. Su hipótesis se basa en que las larvas presentan una pupación parcial que solo alcanza el segmento anterior del cuer-po. Los cambios de color en las larvas en este trabajo se presentaron probablemen-te como una respuesta al estrés generado por la baja temperatura que pudo oca-sionar cambios en su metabolismo. Se ob-servó que las larvas no modificaron su volumen corporal para empupar lo cual puede conducir a pensar que el frío tenga un efecto paralizador sobre su musculatu-ra impidiendo el desarrollo y movilidad. En las larvas del control (19,0°C), el cam-bio de color se presentó cuando comenza-ron la muda para cambiar al estado de pupa. Cuando se presentó ocurrió rápida y uniformemente obteniendo colores más intensos.
Cambios de color observados en larvas de tercer instar de A. fraterculus durante los 15 días del tratamiento cuarentenario de frío “t107 a” de USDA, APHIS. Las larvas después del día ocho se consideran en estado intermedio o pupación parcial.
Conclusiones
El tratamiento cuarentenario “t 107 a” es eficiente para controlar larvas de tercer instar de A. fraterculus debido a que pro-duce un 100% de mortalidad a los ocho días de tratamiento antes de los 15 exigi-dos por lo que permite la seguridad cuarentenaria requerida por USDA, APHIS en exportaciones de feijoa. El cumplimiento de los requisitos cuaren-tenarios exigidos por USDA-APHIS y la garantía de la conservación de la calidad en los frutos resulta en una ventaja com-parativa para los exportadores y para los intereses del país en general debido a que puede significar la apertura del mercado Estadounidense para la feijoa.
Footnotes
Agradecimientos
Los autores expresan agradecimientos a las siguientes personas, instituciones y empresas por sus contribuciones. Al cen-tro de excelencia fitosanitaria CEF, por su colaboración y orientación, a Francis-co González (CEF) por la confirmación taxonómica y a Luís Ernesto Forero por la información suministrada. A William King y Fany Prias del Laboratorio de Cua-rentena Vegetal del ICA (Ibagué, Tolima) por el suministro de las larvas. A las em-presas Disfruta las Feijoas y Exoticland Fruits Ltda. por su contribución y apor-tes para el desarrollo del trabajo.