Abstract
The species Ancognatha scarabaeoides is a coleopteran whose rhizophagous larvae can cause damage in bean, maize, onion, and potato crops, among others. It causes losses between 10 and 80% of the total crop. Cultural methods and especially chemical methods with highly toxic insecticides are used for its control. Considering the high economic and environmental costs caused by the use of these products, a promising alternative is the use of biological insecticides based on entomopathogenic fungi like Metarhizium anisopliae. Giving that in previous research at Corpoica, a strain of this fungus (Mt 020) was selected, due to its biocontrol activity of 76,6% against A. scarabaeoides three granular biopesticide prototypes were developed for soil application. Therefore the objective of this work was to determine their physical and microbiological characteristics, and biocontrol activity. For this purpose, the strain was mass produced and three different granulars (GR1, GR2, and GR3) that varied in components and concentrations were produced. For each granular the particle size, voluminosity, porosity, fluidity, humidity and pH were determined; as well as the concentration in conidia.g−1 and the viability expressed as UFC.g−1. The prototypes and the active source were stored at three temperatures (8, 18 and 28°C) and the viability of the fungus was evaluated monthly. The biocontrol activity was measured in bioassays carried out in the screen house. According to the results obtained, the granular GR1 was selected because of its appropriate physical characteristics, which were equal or inferior to the optimal limits established for each of them. It had 0,31% fine powder, which means that the granule is not fragile; 3,44 ml.g−1 of voluminosity establishing that it will not have manipulation problems; 18% porosity, this small percentage indicates that the granule can resist manipulation without fracturing; it was also established that the product flows easily (angle of repose 27,2°), and so it will not present problems in the filling and packing of large quantities. It had 9,7% humidity, which guarantees the reduction of metabolic processes, and pH of 5,5. In addition, the maximum loss of viability at the three temperatures presented over the six months of storage was 20,7%, and it produced promising and stable levels of pest mortality of up to 43%.
Introducción
Dentro de las plagas que causan el daño mayor en extensas zonas de cultivos en diferentes departamentos del país se en-cuentra la chiza o mojojoy. Este es un in-secto cuyo estado larval ataca el sistema radicular de fríjol, maíz, pastos, zanahoria, cebolla, flores, papa, espárragos, entre otros cultivos (Londoño 1998).
El complejo chiza en Colombia abarca un gran número de especies. Las especies de chiza predominantes parecen estar relacio-nadas con la altura sobre el nivel del mar, es así como a altitudes superiores a 2.500 metros predomina el género Ancognatha, con dominancia de la especie Ancognatha scarabaeoides Erichson (Coleoptera: Scarabaeoidea; Melolonthidae). Esta espe-cie se encuentra ampliamente distribuida en los cultivos de tierra fría y en las regiones altas de clima medio en Colombia (Alvarado 1977). Desde hace algunos años se vienen aumentando los niveles de población de este insecto, lo cual es atribuido al uso in-discriminado de plaguicidas y a cambios en el medio ambiente, que afectan los factores de regulación natural bióticos y abióticos, favoreciendo de este modo el aumento de la población del insecto (Londoño 1998). Las pérdidas ocasionadas por esta especie son considerables, y llegan hasta el 100% en algunos cultivos como fresa, hortalizas y flores (Rodríguez 1997). Para el control de este insecto, se han venido utilizando mé-todos culturales, tales como la rotación de cultivos y las aradas profundas, sin obtener resultados satisfactorios (Alvarado 1977).
Sin embargo, a nivel nacional, comúnmen-te se han utilizado plaguicidas químicos, varios de los cuales son productos altamen-te tóxicos, es el caso de Carbofurán, Diazinon y Hostation, entre otros (Orellana 1983). Estos productos, además de representar costos económicos altos pueden causar problemas de equilibrio en los ecosistemas incidiendo negativamente en el control ejer-cido por enemigos naturales (Rodríguez 1983). El uso de dichos insecticidas en Co-lombia tienen un costo aproximado de medio billón de dólares cada año; repre-sentando solamente un 5% de la inversión realizada en agentes microbianos de con-trol (Gómez y Villamizar 1996).
Una alternativa promisoria para el control de esta plaga es la utilización de métodos biológicos (Rodríguez 1983), debido a que su uso ha tenido notable impacto en los últimos años especialmente en cultivos perennes. Estas alternativas biológicas in-cluyen el uso de depredadores, parasitoi-des y microorganismos entomopatógenos (Londoño 1998).
A nivel mundial se han utilizado con éxi-to microorganismos entomopatógenos para el control de esta plaga, tales como Metarhizium anisopliae, Beauveria ba-ssiana y bacterias como Bacillus popillae que causa una enfermedad denominada muerte lechosa (Londoño y Ríos 1997). Por su parte, los hongos entomopatóge-nos tales como M. anisopliae penetran en el hospedero directamente degradan-do su cutícula y no necesitan ser ingeri-dos, presentan más especificidad que los químicos, crecen fácilmente en sustratos simples y económicos haciendo factible su producción masiva con costos bajos y, hasta el momento, no se le conocen efectos adversos sobre el ambiente, los animales y el hombre (Galán y Támez 1993).
Existen diferentes tipos de presentación para los bioinsecticidas de aplicación al suelo y su diseño depende de los hábitos y del comportamiento de la plaga objeto de control (Gómez et al. 1997). Algunos tipos de formulaciones existentes para di-chos bioinsecticidas son: polvos para es-polvoreo, polvos humectables, líquidos emulsionables y granulados; estos últimos presentan mayor facilidad en su manipu-lación y aplicación al suelo, ya que permi-ten que el producto entre en contacto directo con plagas de hábito rastrero y fa-vorecen la diseminación y persistencia del biocontrolador en el suelo (Gómez et al. 1997). Sin embargo, para la formulación de un bioplaguicida de aplicación al suelo destinado al control de plagas tales como A. scarabaeoides, se deben tener en cuen-ta las condiciones ambientales en las cua-les se encuentra el cultivo. Por lo tanto, se hace necesario que la formulación garan-tice la absorción de la humedad del medio ambiente, para facilitar la germinación del microorganismo y conferirle a éste un sustrato adecuado para su establecimien-to en el suelo. Igualmente es importante tener en cuenta, que la formulación, espe-cialmente si es un granulado, posea ca-racterísticas físicas adecuadas, tales como fluidez, humectabilidad, tamaño de partí-cula, voluminosidad, humedad y PH (ICONTEC 1992, 1998). Dichas caracterís-ticas pueden garantizar la viabilidad del microorganismo en condiciones de alma-cenamiento y permiten detectar si los granulados presentan problemas, ya sea por su difícil manipulación o por dificulta-des en los procesos de llenado de los reci-pientes en que se almacena (Voight y Borns 1979).
En Colombia la producción de bioplagui-cidas es realizada en muchos casos en forma artesanal, sin estudios que respal-den la utilización de cepas con actividad biocontroladora alta. Algunos de estos productos carecen de una caracterización adecuada que asegure su efectividad y cumplimiento de las especificaciones de la etiqueta; por lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue el de determinar las características físicas, microbiológicas y la actividad biocontroladora de prefor-mulados granulados a base de M. ani-sopliae para el control de la chiza A. scarabaeoides.
Materiales y Métodos
En el presente estudio se utilizó la cера del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae Mt020, proveniente de Enviga-do (Antioquia), aislada directamente de larvas de Ancognatha scarabaeoides. Esta cepa fue suministrada por el Centro de In-vestigaciones La Selva de Corpoica.
Con el propósito de mantener el material biológico, la cepa se incorporó al Banco de Germoplasma del Laboratorio de Con-trol Biológico de Corpoica C.I. Tibaitatá, en viales con Agar Papa Dextrosa (PDA) a una temperatura de 4°C y antes de ser uti-lizada en los ensayos biológicos fue reactivada en larvas de tercer ínstar de A. scarabaeoides.
Producción masiva del principio activo
La producción masiva del principio activo Metarhizium anisopliae (ceра Mt020), para la posterior formulación de los granulados, se realizó en bandejas de aluminio de 20 cm de largo por 14 cm de ancho y 3 cm de profundidad que conte-nían 34 g de salvado y 150 ml de extracto de arroz. Las bandejas se cubrieron con papel de aluminio y se esterilizaron du-rante 20 minutos. Posteriormente, cada bandeja se inoculó con 5 ml de una sus-pensión de M. anisopliae que contenía 10−1 conidios.ml−1 y se cubrieron con una lámi-na plástica permeable al gas para evitar posibles contaminaciones y para permitir intercambio de gases, facilitando el creci-miento del hongo. Estas bandejas se incu-baron en un cuarto de crecimiento con luz constante y con un temperatura de 25°C durante 15 días. Al cabo de este tiempo el plástico que cubría las bandejas se cam-bió por toallas de papel, para permitir un mejor intercambio gaseoso con el fin de iniciar el proceso de secado del principio activo, el cual se llevó a cabo en una estufa con corriente de aire a una temperatura de 28°C durante 2 días. Una vez que la biomasa se encontró seca, se molió y fue pasada por una malla de 100 micrómetros para obtener un tamaño de partícula ade-cuado.
Preparación de los excipientes y proceso de formulación de los granulados
Los excipientes se mezclaron con el principio activo de acuerdo con las com-posiciones indicadas en la tabla 1. Una vez se obtuvo una masa uniforme, ésta se granuló por extrusión a través de una malla con un tamaño de poro de 1 mm apro-ximadamente. Posteriormente, los granu-lados se secaron durante dos días a 28°C en un estufa con corriente de aire; poste-riormente, se regranularon para obtener un tamaño de partícula uniforme.
Pérdida de la viabilidad de preformulados a base de M. anisopliae bajo condiciones de almacenamiento a tres temperaturas (Tratamientos con letras iguales no presentan diferencias significativas; Tukey α=0,05).
Composición de los granulados a base de M. anisopliae evaluados
Caracterización física de los granulados
Se evaluaron las propiedades físi-cas de voluminosidad, fluidez, tamaño de partícula, porosidad, humedad y pH.
La determinación del tamaño de partícula se llevó a cabo mediante la técnica de gravimetría (Voight y Borns 1979). La de-terminación de la voluminosidad se realizó por el método de peso constante - volu-men variable (Voight y Borns 1979). Para determinar la porosidad se pesaron 25 gramos de cada uno de los granulados y se colocaron en una probeta, se leyó el volumen ocupado por el material (V1) y posteriormente, se apisonó el material le-vantando la probeta hasta la altura máxi-ma permitida y dejándola caer libremente sobre una base de madera, esta operación se repitió hasta el momento en que no se presentó variación en el volumen dado por la probeta (Vf). La porosidad se calculó utilizando la fórmula matemática: Porosidad=1–(a/v), en donde a es la densidad global de la muestra (W muestra / V1) y v es la densidad real de la muestra (W mues-tra / Vf) (Voight y Borns 1979).
La fluidez se determinó por el método de fluidez estática (Voight y Borns 1979; Helman 1982, ICONTEC 1992). La deter-minación del porcentaje de humedad se realizó por el método de pérdida de peso por secado (USP XXIII 1995). Para la deter-minación del pH, se realizó una suspen-sión 1:10 P/V de cada granulado en agua destilada y se midió el pH con un potenció-metro Cole - Parmer, previamente calibra-do (CENICAFÉ 1996).
El diseño experimental de todas las prue-bas de caracterización física fue completa-mente al azar, con tres repeticiones para cada granulado, utilizando una sola répli-ca a través del tiempo por ser sólo un lote de producción. Con los resultados obteni-dos fue posible establecer los límites ópti-mos de aceptación para cada una de las características de los diferentes granulados.
Caracterización microbiológica de los granulados
La viabilidad se determinó realizando diluciones sucesivas en tubos que conte-nían 9 ml de Tween 80 al 0,1%, posterior-mente, se inocularon 0,1ml de las diluciones 10−6, 10−7 y 10−8 en cajas de Petri que contenían Agar Saboureaud Rosa de Bengala (SBR). Estas cajas fueron incuba-das durante 8 días, tiempo después del cual se realizó el conteo de las unidades formadoras de colonia (UFC), expresando finalmente los resultados como UFC.g−1 de granulado.
El diseño experimental fue completamen-te al azar, y se utilizaron seis tratamientos, cada uno con tres repeticiones y 11 indivi-duos por repetición. Los tratamientos consistieron en los tres preformulados granulados por evaluar (T1, T2, T3), el hongo sin formular, es decir, el principio activo (T4), el testigo tratado (T5), el cual consistió en una formulación del granula-do sin principio activo utilizando todos los excipientes con el fin de verificar que éstos no produjeran la muerte al insecto y el tes-tigo absoluto (T6). Las larvas se recolecta-ron 15 días antes del inicio del bioensayo; se trasladaron a la casa de malla y se ubi-caron en cubetas con suelo y suministro de alimento con el propósito de brindar-les un tiempo para su adaptación a las condiciones experimentales.
Cada unidad experimental consistió en una cubeta plástica de 38 cm de largo, 28 cm de ancho y 15 cm de profundidad, en la cual se colocaron 5 kg de suelo tamizado, incorporando la cantidad determinada de cada uno de los granulados para ajustar en cada cubeta el doble de la CL50 (1,58 x 107 conidios.g−1 de suelo) determinada para esta cepa en estudios preliminares realizados en el Laboratorio de Control Biológico de Corpoica. Posteriormente, se ubicaron en cada cubeta 11 larvas de ter-cer ínstar de A. scarabaeoides, debido que en ensayos previos se estableció este nú-mero de insectos como el adecuado para evitar una sobrepoblación que acarrearía un posible ataque entre ellas. En cada cu-beta se ubicó un cespedón de pasto Kikuyo (Penisetum clandestinum) como soporte para la alimentación de los insectos du-rante el bioensayo.
Se realizó el registro de mortalidad de lar-vas al día seis y al día 12 del inicio del bioensayo y a partir de este último, cada 10 días. Las larvas muertas se sometieron a cámara húmeda, que consistieron en cajas de Petri estériles, que tenían en su base una toalla de papel húmeda, la cual se cambia-ba todos los días con el fin de evitar conta-minación. Las cajas se mantuvieron a una temperatura promedio de 18°C con el pro-pósito de evidenciar la esporulación típica de este entomopatógeno.
Los resultados netos de mortalidad se corrigieron con el testigo mediante la fór-mula de Schneider - Orelli (Ciba Geygi 1973):
Porcentaje de eficacia=(b−k)(100−k)×100
Donde
Adicionalmente, estos resultados se some-tieron a un análisis de varianza y a compa-ración múltiple de medias de Tukey, con el fin de evidenciar diferencias significativas entre cada uno de los tratamientos.
Resultados y Discusión
Producción masiva del principio activo
En el medio de cultivo utilizado (salva-do - extracto de arroz), el hongo formó un micelio firme y de color blanco que se evi-denció a los cuatro días de incubación, el cual se fue tornando verde oscuro a medi-da que se producía la esporulación, la cual se empezó a observar a partir del décimo día de incubación. Posteriormente, fue to-mando una apariencia polvosa y al décimo quinto día de incubación se suspendió la misma, ya que todo el medio estuvo colo-nizado y con una abundante producción de conidios. Las bandejas fueron secadas y molidas. Una vez se obtuvo el principio activo puro (medio con el hongo), des-pués de los procesos de secado y molido, se determinó la concentración y viabilidad del mismo, siendo la primera de 1,7x1010 conidios.g−1 y la segunda de 3,5x10¹¹ UFC.g−1. Es importante resaltar que la producción masiva se realizó en salvado de trigo, ya que este sustrato tiene un efecto inductor de la virulencia de M. anisopliae (Villamizar 1998).
Caracterización física de los granulados
Se evaluaron las propiedades físicas de voluminosidad, fluidez, tamaño de par-tícula, porosidad, humedad y pH.
Tamaño de Partícula. En el proceso de pro-ducción de los granulados, se tuvieron en cuenta dos etapas indispensables para la obtención de un tamaño de partícula uni-forme, los procesos de granulación y regranulación.
Los resultados de tamaño de partícula de los granulados fueron obtenidos median-te la técnica de gravimetría (Tabla 2), se analizaron mediante una distribución de frecuencias, encontrándose que para los tres granulados el porcentaje mayor de peso retenido se obtuvo en el tamiz 18 con tamaño de poro de 0,84 mm, con por-centajes de 88,3, 86,5 у 87,1%; para los granulados GR1, GR2 y GR3, respectiva-mente; por otra parte, los porcentajes de peso retenido en el tamiz inmediatamente anterior (10), el cual tiene un tamaño de poro de 1,42 mm fueron del 0,22, 0,13 y 0,77% para los granulados GR1, GR2 y GR3, respectivamente; por consiguiente, estos datos permiten afirmar que la mayo-ría de las partículas de los tres granulados se encuentran en un rango de tamaño de partícula entre 0,84 mm y 1,42 mm.
Efecto biocontrolador de preformulados granulados a base de M. anisopliae sobre A. scarabaeoides (GR = Granulados, Pa = Principio Activo, Ex = Excipientes) (Tratamientos con letras iguales no presentan diferencias significativas; Tukey α=0,02).
Distribución de frecuencias para la determinación del tamaño de partícula de los granulados por la técnica de gravimetría
Valencia (2000) encontró, para cuatro preformulaciones granulares a base del hongo entomopatógeno Beauveria ba-ssiana para el control del gusano blanco de la papa Premnotrypes vorax, un tama-ño de partícula entre 1,5 mm y 2 mm y al ser evaluada su actividad biocontroladora, los porcentajes de control fueron 100, 100, 96,5 у 89,6%, indicando que dicho tamaño fue adecuado para este tipo de productos. Los granulados de Metar-hizium anisopliae tienen un tamaño de gránulo menor al obtenido por Valencia, lo cual podría mejorar el cubrimiento y distribución del producto en la aplicación, repercutiendo directamente sobre la acti-vidad biocontroladora. Además, los preformulados granulados de M. ani-sopliae presentaron una tamaño de par-tícula similar a la del bioplaguicida comercial BIO 1020 (0,8 mm) a base de M. anisopliae, indicando que los granu-lados desarrollados poseen características adecuadas para este tipo de formula-ciones de aplicación al suelo.
De acuerdo con los resultados obtenidos en cuanto a la proporción de polvos finos de cada uno de los granulados, se pre-sentaron porcentajes muy bajos con valores de 0,31, 0,25 y 0,11% respectiva-mente, para los granulados GR1, GR2 y GR3; indicando que ninguno de los preformulados posee una consistencia frágil en el gránulo, posiblemente debi-do a que en el proceso de manufactura se utilizó la cantidad y concentración ade-cuada de agente aglutinante, lográndose una adhesión alta de las partículas. Ade-más, los granulados elaborados median-te la técnica de extrusión manual tienden a presentar una dureza alta y por lo tanto fragilidad baja, por esto, se espera que los granulados no presenten problemas en el producto terminado cuando sea al-macenado por períodos de tiempo pro-longados, evitándose su compactación en la base, lo que impediría el flujo libre del producto y la utilización total del mismo (Morales 1993).
Adicionalmente, la presencia baja de pol-vos finos en los productos aseguran que una mayor cantidad de los mismos lleguen al sitio blanco, ya que el gránulo por su peso, cae directamente en el sitio de apli-cación, mientras que los polvos finos son arrastrados por el viento y además podrían ocasionar obstrucción de las vías respira-torias de las personas que manipulan el producto en su manufactura y aplicación (Valencia 2000).
Voluminosidad. Los granulados GR1, GR2 y GR3 presentaron una voluminosidad adecuada, con valores de 3,44, 3,25 у 3,6 ml.g−1 respectivamente (Tabla 3), ya que no fueron significativamente diferentes del lí-mite máximo para dicho parámetro, el cual debe ser de 3 ml/g para que los materiales no presenten problemas durante la mani-pulación (Martín 1967). Resultado que permite sugerir que posiblemente ningu-no de los tres granulados presentará pro-blemas en los procesos de llenado de los recipientes, mezcla y transporte del pro-ducto terminado a escala industrial.
Características de los granulados de Metarhizium anisopliae
Valencia (2000) obtuvo voluminosidades de 1,68, 1,65, 1,86 y 1,65 ml.g−1 para cua-tro granulados a base de B. bassiana, de-bido a que utilizó excipientes y principio activo (arroz esporulado y molido) con voluminosidad baja. Sin embargo, a pesar de haber usado para los granulados de M. anisopliae excipientes de baja volumino-sidad, el principio activo es un homoge-neizado del medio de cultivo esporulado, el cual está constituido en su mayoría por salvado de trigo que por ser un material muy voluminoso pudo ser la causa de que esta característica estuviera por encima del límite óptimo.
Porosidad. Esta característica es de gran importancia para los granulados, ya que es la medida de los espacios intra-particulares de un sólido y determina su fragilidad.
Los resultados obtenidos en esta prueba fueron de 18, 19 y 25% para los granula-dos GR1, GR2 y GR3; esto indica que hay una pequeña proporción de espacios en-tre partículas que forman los gránulos y por lo tanto, se espera que puedan resistir la manipulación sin fracturarse, conservan-do su tamaño de partícula y sin producir polvos finos que generen pérdidas del producto. El valor óptimo para esta carac-terística es inferior a 30% y los tres granu-lados se encuentran por debajo de este valor, lo que permitiría deducir que los tres formulados son más compactos, caracte-rística deseable para que el producto no sea arrastrado por el viento en el momen-to de su aplicación.
Fluidez. Los valores de los ángulos de re-poso obtenidos para los granulados GR1 y GR3, fueron los menores, siendo éstos de 27,2° y 29,8° respectivamente, y el GR2 presentó un mayor ángulo de reposo con un valor de 30,6° (Tabla 3).
De acuerdo con el valor óptimo para esta característica (< 30°), valor por debajo del cual se considera que un producto posee alta fluidez (Voight y Borns 1979), los re-sultados obtenidos para los granulados GR1 y GR3 se encuentran por debajo de dicho límite, sugiriendo que los granulados fluyen fácilmente y no presentarán proble-mas cuando sean manipulados en gran-des cantidades en los procesos de llenado y empaque principalmente durante una producción industrial, además, la alta flui-dez de los formulados favorecería la aplicación del producto por parte del agri-cultor pues permitiría una manipulación fácil.
Humedad. La humedad residual de un pro-ducto granulado, desarrollado a base de un hongo, es de gran importancia ya que influye directamente en la viabilidad del mismo. Los resultados de la prueba de humedad obtenidos para los tres granu-lados presentaron valores aceptables, sien-do éstos del 9,7, 6 y 3,3% para los granulados GR1, GR2 y GR3, respectiva-mente (Tabla 3). Aunque el valor de por-centaje de humedad del GR1 es mayor comparado con los otros dos granulados, éste no sobrepasa el valor sugerido para este tipo de productos, el cual es inferior al 10%, para asegurar que se reduzcan al mínimo los procesos metabólicos del mi-croorganismo y así no se produzcan pér-didas considerables de la viabilidad durante el almacenamiento (Valencia 2000).
PH. Los valores de pH para los granulados GR1, GR2 y GR3 fueron de 5,5, 5,4 y 5,5, respectivamente (Tabla 3); valores adecua-dos para estos productos ya que se encuen-tran entre 5 y 7, rango óptimo para el buen desarrollo de este tipo de microorganismos (Cenicafe 1996); lo que indica que este parámetro posiblemente no afectará la via-bilidad de Metarhizium anisopliae.
Caracterización microbiológica de los granulados
Determinación de la concentración
La determinación de la concentración de cada uno de los granulados expresada como conidios.g−1, se evaluó desintegrándolos en agua destilada y llevando a cabo la cuantificación de conidios en cámara de Neubauer.
Las concentraciones para los granulados GR1, GR2 y GR3 fueron de 4,8 x 101 conidios.g−1, 5,2 x 101 conidios.g−1 y 6,8 x 101 conidios.g−1, respectivamente (Tabla 3). Este resultado indica que a pesar de las diferencias en la composición de los preformulados, todos presentan una con-centración similar y adecuada para este tipo de producto, considerando que los productos comerciales a base de hongos entomopatógenos presentan concentra-ciones que oscilan entre 107 conidios.g−1y 1010 conidios.g−1.
Estabilidad microbiológica de los granulados
Uno de los aspectos básicos a evaluar en un bioplaguicida es la estabilidad de la viabilidad del microorganismo cuando éste es almacenado, ya que las condicio-nes de almacenamiento, pueden afectar dicha característica e influir directamente en la actividad biocontroladora del pro-ducto.
Los resultados obtenidos en las pruebas de estabilidad de la viabilidad de M. anisopliae a las tres temperaturas de al-macenamiento (8, 18 y 28°C) para los tres granulados y para el principio activo (hon-go sin formular) mostraron una pérdida de la misma a través del tiempo (seis me-ses), la cual osciló entre el 16 y el 36% (Fig. 1).
A 28°C, los granulados GR2 y GR3 presen-taron pérdidas de la viabilidad del 32,7 y 32,9%, respectivamente; en comparación con el granulado GR1 y con el control (principio activo) que presentaron pérdi-das del 20,7 y 22%, respectivamente. La prueba de comparación múltiple de me-dias de Tukey con un a=0,05, no detectó diferencias significativas entre las pérdidas de viabilidad de los granulados y del prin-cipio activo, indicando que posiblemente ninguna de las formulaciones o los proce-sos incluidos en la formulación, confirie-ron estabilidad a los conidios cuando se almacenaron bajo estas condiciones.
Por otra parte, los resultados obtenidos con los diferentes tratamientos almacena-dos a 18°C, mostraron un comportamien-to similar al que se obtuvo a 28°C, en que los granulados GR2 y GR3 presentaron pérdidas considerables de la viabilidad del 36,5 y del 33,2% respectivamente; mien-tras que el granulado GR1 y el control (prin-cipio activo) presentaron pérdidas de viabilidad inferiores, las cuales, fueron del 21,9 y del 17%, respectivamente (Fig. 1). La prueba de comparación múltiple de medias de Tukey con un a=0,05 determi-nó que no hubo diferencias significativas entre la pérdida de viabilidad de los tres granulados, pero sí entre las del granulado GR3 y el control (principio activo), lo que sugiere que a esta temperatura, algunos de los excipientes utilizados en el granu-lado GR3 podrían haber afectado la esta-bilidad del microorganismo bajo estas condiciones de almacenamiento. A pesar de no encontrarse diferencias estadísticas entre la viabilidad de los granulados GR1, GR2 y el principio activo, se observó que los granulados presentaron una mayor pérdida de la viabilidad, sugiriendo que de igual forma que con el granulado GR1, alguno de los excipientes o de las opera-ciones involucradas en el proceso de ma-nufactura, tuvieron un efecto negativo sobre la viabilidad del hongo.
La viabilidad a la temperatura de 8°C para los diferentes granulados fue la que pre-sentó mayor estabilidad durante el alma-cenamiento. Para los granulados GR1, GR2 y GR3 hubo pérdidas de la viabilidad del 16,2, 23,1 y 21%, respectivamente, mien-tras que para el control (principio activo) ésta fue del 8,7%. El análisis estadístico con un a=0,05 no detectó diferencias sig-nificativas entre las pérdidas de viabilidad de los tres preformulados y el principio activo, resultado que sugiere que a esta temperatura la viabilidad del microorga-nismo no se ve afectada por los excipientes o por el proceso de formulación en los tres granulados y dicha pérdida podría deber-se a un efecto del tiempo de almacena-miento (seis meses).
La prueba de comparación múltiple de medias de Tukey no detectó diferencias significativas para cada uno de los tra-tamientos a las tres temperaturas de alma-cenamiento, este resultado sugiere que la temperatura no tuvo un efecto determi-nante en la pérdida de viabilidad del mi-croorganismo. Sin embargo, en todos los casos las pérdidas fueron superiores cuan-do el almacenamiento se realizó a 28°C, seguidas por las pérdidas encontradas a 18°C y por último las producidas durante el almacenamiento a 8°C; esto se puede atribuir a que a temperatura ambiente y superiores a ésta, el metabolismo del mi-croorganismo se podría encontrar aún ac-tivo y la humedad baja y la falta de nutrientes y oxígeno podrían producir la muerte celular, siendo recomendable a partir de estos resultados, el almacena-miento de los preformulados o del princi-pio activo a 8°C para disminuir las pérdidas de viabilidad.
Resultado similar registró Valencia (2000) con los granulados de B. bassiana para el control del gusano blanco de la papa Premnotrypes vorax, en que las menores pérdidas de viabilidad se presentaron des-pués de seis meses de almacenamiento a una temperatura de 8°C, las cuales fueron del 8%, mientras que a 18 y 28°C las pérdi-das fueron del 10,6 y 10,1%, respectiva-mente. Este resultado confirma que la temperatura tiene un efecto negativo so-bre la viabilidad de los microorganismos bajo condiciones de almacenamiento.
Las pérdidas mayores de viabilidad de M. anisopliae a las tres temperaturas se regis-traron en los granulados GR2 y GR3, los cuales tuvieron porcentajes de humedad inferiores al presentado por el granulado GR1. Este factor también podría ser causal de la pérdida de viabilidad, ya que un excesivo secado puede ocasionar una pér-dida de agua intracelular y afectar negati-vamente la estabilidad de la célula, tal como lo encontró Valencia (2000), cuando alma-cenó un granulado con un porcentaje de humedad muy bajo (2,21%), y encontró pérdida de viabilidad máxima de 17,3%.
Actividad biocontroladora de los granulados
Cuando se realizó la evaluación de la acti-vidad biocontroladora de los granulados, los porcentajes de mortalidad acumulada obtenida 32 días después de iniciado el bioensayo para los tratamientos GR1, GR2, GR3, principio activo y testigo tratado (excipientes) fueron del 42,4, 48,4, 27,2, 27,2 y 30,3%, respectivamente (Fig. 2). Estos porcentajes de mortalidad son ba-jos si se tiene en cuenta que el bioensayo se realizó en condiciones controladas, por lo que se esperarían porcentajes de con-trol superiores, ya que se le están propor-cionando al microorganismo, todas las condiciones para que ejerza su actividad biocontroladora. Sin embargo, en gene-ral, los resultados señalados de control de chiza con hongos entomopatógenos son bajos. Londoño y Ríos (1997) cuando eva-luaron diferentes cepas de M. anisopliae y B. bassiana para el control de dos especies de chizas predominantes en Antioquia, Phyllophaga obsoleta y Anomala undu-lata, obtuvieron porcentajes de mortalidad acumulada del 40% después de 20 días de iniciado el bioensayo.
El porcentaje de mortalidad obtenido en el testigo absoluto para este bioensayo fue del 12,1%; un valor de mortalidad acepta-ble para ensayos biológicos (CIBA-GEIGY 1973) y posiblemente se puede atribuir a factores tales como el estrés causado por el confinamiento de las chizas en las cubetas y al efecto de las nuevas condicio-nes ambientales.
La prueba de comparación múltiple de medias de Tukey (a=0,2) determinó que existieron diferencias significativas entre los porcentajes de mortalidad ocasiona-dos por los granulados GR1, GR2 y los excipientes con respecto a los resultados obtenidos con el granulado GR3, el prin-cipio activo y el testigo, pero no detectó diferencias entre estos últimos. Los por-centajes de mortalidad producidos por los granulados GR1 y GR2 fueron superiores y significativamente diferentes de los producidos por el principio activo por lo que se sugeriría que la formulación potencializa la actividad biocontroladora del microorganismo, posiblemente por-que el granulado posee un soporte nutri-cional que le brinda al hongo la posibilidad de crecimiento. Además, los granulados in-cluyen en su formulación un acondiciona-dor de humedad que les proporciona una mayor posibilidad de captación de agua para que el microorganismo pueda activar sus procesos metabólicos rápidamente y por ende desarrollar su actividad biocontro-ladora con más eficacia.
Se observó que los excipientes tienen acti-vidad sobre el insecto, ya que el porcentaje de mortalidad producido por este trata-miento fue superior y significativamente diferente del obtenido con el principio acti-vo puro y con el testigo absoluto. Esto se podría atribuir a un efecto nocivo del di-luente, el cual es una arcilla que podría te-ner efecto ligeramente corrosivo sobre la delicada cutícula del insecto, básicamente causando una resequedad excesiva de la misma. Este efecto de los excipientes no tendría impacto sobre el hombre, pero po-siblemente sí sobre otros estadíos larvales de insectos que puedan ser susceptibles al mencionado efecto físico.
En el tratamiento que corresponde al gra-nulado GR3 se presentó una mortalidad inferior y significativamente diferente de la obtenida con los otros granulados. Sin embargo, el porcentaje de mortalidad para este preformulado no fue estadísti-camente diferente del obtenido con el principio activo puro; lo que indicaría que la formulación de este prototipo no mejora la actividad biocontroladora del microorganismo sobre el insecto. A pe-sar de que este granulado también con-tiene los excipientes que posiblemente tienen un efecto sobre la chiza, es pro-bable que la concentración de éstos en el prototipo, o las características físicas producidas por su combinación no afec-ten la actividad biocontroladora del mi-croorganismo.
Teniendo en cuenta los resultados obteni-dos en esta etapa de la investigación, se sugiere integrar varios microorganismos en el manejo de poblaciones de chiza y la utilización de otras alternativas de control dentro de un programa de manejo inte-grado de plagas.
De acuerdo con las características físicas de cada uno de los granulados, su acti-vidad biocontroladora y su estabilidad en condiciones de almacenamiento, el granulado GR1 presentó los valores más adecuados para cada una de las carac-terísticas físicas, un porcentaje de mortalidad del 42% y pérdidas no con-siderables en los porcentajes de viabili-dad durante el almacenamiento a una temperatura de 8°C. Además, es impor-tante tener en cuenta que el granulado GR1 tiene los menores costos de pro-ducción, ya que esta formulación no contiene uno de los excipientes que sí está incluido en los granulados GR2 y GR3, lo que permitiría concluir que el granulado GR1 es el preformulado que exhibe las propiedades más adecuadas para ser optimizado y evaluado en estu-dios posteriores.
Conclusiones
Los tres preformulados granulados a base de Metarhizium anisopliae presentaron características físicas y microbiológicas adecuadas para este tipo de productos. Los excipientes utilizados afectaron la estabilidad de la viabilidad del hongo bajo condiciones de almacenamiento a 8, 18 y 28°C. La estabilidad de la viabilidad del hongo se afectó en menor medida en la tempera-tura de almacenamiento de 8°C. Los preformulados GR1 y GR2 mostra-ron actividad biocontroladora promisoria sobre larvas de A. scarabaeoides. Se seleccionó el granulado GR1 por ex-hibir los valores óptimos para las caracte-rísticas físicas y microbiológicas y una promisoria actividad biocontroladora.