Abstract
A fundamental process of all living cells is the detection and selective uptake of chemical molecules which give origin to chemical communication at many biological levels. This knowledge offers the possibility to develop effective methods for pest control whit no contamination effects. Aromatic plants have traditionally been used in the treatment of illnesses and control of insects. Their essential oils have been known for their therapeutic, insecticidal and antifungal activity. Some of the most popular oils are extracted from some species of the Ocimum genus. In this study the composition and the chemical profile of the essential oil from Ocimum micranthum Willd (cinnamon basil) was investigated. Its fungicide and pesticide potentials were also evaluated with the purpose of contributing to the knowledge and use of a natural product. The essential oil obtained by hydrodistillation of wild plants, all gathered in Ibagué-Tolima, was analysed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The chemical profile found was phenylpropane > monoterpene > sesquiterpene, being the methyl cinnamate (79.8%) and methyl chavicol (12.3%) the most abundant compounds. The insecticide potential was assayed in Musca domestica L. (two day all adults), using the toxicity by contact method, and the antifungal activity was tested on Fusarium oxysporum Schi. by incorporating the essential oil in the culture medium. The essential oil showed insecticidal and antifungal activity.
Keywords
Introducción
La albahaca, perteneciente al género Ocimum (Lamiaceae), es originaria de Persia y Asia Menor, crece espontánea en la India y en las regiones cálidas del Africa. En Colombia existen cultivos de albahaca en Antioquia, Cundinamarca y Valle (Álvarez 1995). En el Tolima se observan cultivos de diferentes variedades tales como albahaca crespa, blanca, castilla y albahaca morada (Rojas y Morales 1995). En el género Ocimum las flores son hermafroditas y puesto que la polinización cruzada es abundante, resulta elevada la cantidad de subespecies, variedades y formas.
La albahaca tiene amplios usos etnobotánicos, utilizándose preferencialmente en estado de floración. Ocimum micranthum W., en particular, es aplicada en: dolor de oído, cabeza y muelas, tratamiento de resfriados, estreñimiento, afecciones de riñones y vejiga, fiebre, desorden menstrual; también se le utiliza para provocar sudor, desentumecer los tejidos golpeados, como desinfectante, hipoglicemiante, estimulante del apetito, tranquilizante del sistema nervioso; la semilla elimina los terigios o nubosidades de los ojos (Moreno et al. 1987; De A Riberiro et al. 1986).
El vegetal es una rica fuente de aceite esencial utilizado como saborizante de alimentos, productos dentales, en perfumes, en rituales tradicionales y en medicina (Simon et al. 1990; Bischoff 1993). Se han realizado numerosas investigaciones con el propósito de establecer las propiedades fungicidas (Reuveni et al. 1984; Tripathi et al. 1985; Dubey y Kishore 1987; Gangrade et al. 1989; Gulati y Sinha 1989; Singh y Gupta 1992; Amvam et al. 1998), insecticidas (Chogo y Crank 1981; Nishida et al. 1984; Chavan et al. 1986; Dube et al. 1989; Obeng-Ofori y Reichmuth 1997), antimicrobiales (Prasad et al. 1986; Janssen et al. 1989; Thomas 1989; Simon et al. 1990; Cáceres et al. 1993) y antioxidantes (Tiziana et al. 1998) de sus aceites esenciales.
Muchas especies de Ocimum son utilizadas en diferentes regiones como insecticida y repelente de moscas y murciélagos. Más frecuentes son las investigaciones realizadas con otras especies de este género para estudiar su actividad contra hongos, bacterias y coleópteros (CAB 1973-1993; Weaver et al. 1994; Amvan et al. 1998). Tomando como base estos estudios y los de composición química de algunas variedades de albahaca realizados en nuestro laboratorio, se esperan encontrar en el aceite esencial de O. micranthum compuestos que hagan de ella un vegetal con bioactividad destacada.
La utilización tradicional de plantas con actividad biológica hoy en día se ha orientado hacia el control de insectos y a la búsqueda de compuestos bioactivos. Chogo y Crank (1981) probaron el aceite esencial de O. suave por su actividad antimicrobial y como repelente de mosquitos. El aceite esencial de O. basilicum ocasionó 100% de mortalidad del mosquito Culex pipiens fatigans (Diptera: Culicidae) (Chavan et al. 1986). Bhattacharyya y Bordoloi (1986) probaron el aceite esencial de O. gratissimum para retardar el crecimiento de Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) y Tribolium castaneum (Coleoptera: Scolytidae); en todas las concentraciones probadas (0.05, 1 o 5%) el aceite ocasionó considerable retardamiento en la actividad larval de D. melanogaster. Las propiedades repelentes del aceite de O. canum se ensayaron en mosquitos (Marazanye et al. 1988). Cabe anotar que son pocas las investigaciones realizadas para probar el potencial insecticida del aceite esencial de O. micranthum contra mosca casera.
La contribución de este estudio fue determinar la composición química y el quimiotipo del aceite esencial de albahaca Canela (O. micranthum), evaluar en condiciones de laboratorio las propiedades insecticidas del aceite esencial contra Musca domestica (Diptera: Muscidae) y la actividad fungitóxica en Fusarium oxisporum Schi (Moniliales: Tuberculariaceae), con el propósito de determinar su uso potencial. Adicionalmente, se relacionó la bioactividad del aceite con los constituyentes químicos encontrados en él.
Materiales y Métodos
Material vegetal
La muestra vegetal se recolectó en el área urbana y suburbana del municipio de Ibagué (Tolima), 1390 msnm. y 29°C, en donde la planta crece espontáneamente en forma silvestre en huertos caseros, bordes de caminos, campos cultivados y potreros. La identificación del material se realizó en el Herbario Toli de la Universidad del Tolima (ejemplar N° 6995), utilizando las claves taxonómicas establecidas por Moreno et al. (1987).
Material entomológico
Se utilizaron adultos de Musca domestica (dos días) para medir la actividad insecticida del aceite esencial. La producción masiva del insecto se realizó en cámaras de madera de 40 × 40 cm. La unidad experimental la conformaron 20 parejas de insectos provenientes de un expendio de carne. La dieta alimenticia suministrada a los adultos consistió de miel de abejas y leche en polvo con azúcar. Las larvas se alimentaron con aserrín, levadura, harina de trigo y harina de fríjol en proporción 12:8:4:1 (w/w) y agua destilada (Trujillo y Vergara 1989).
Material fúngico
Las propiedades fungicidas de los volátiles de O. micranthum se evaluaron sobre Fusarium oxisporum Schi. f. sp. lycopersici Sacc. La cepa fue suministrada por los laboratorios de Fitopatología CORPOICA-NATAIMA, Espinal-Tolima, a partir de tallos de plantas de tomate de árbol (Cyphomandra betacea (Cav.) Sendt), utilizando un medio selectivo para F. oxysporum constituido por jugo de tomate, agar bacteriológico, cloramfenicol y carbonato de calcio en proporción 5:4:1:6 w/w.
Procedimiento de extracción
El aceite esencial (volátiles) se extrajo por hidrodestilación: 20 g de parte aérea seca al aire se destilaron con agua (1:20), durante una hora, en un equipo de destilación circulatoria descrito por Clevenger (Marotti et al. 1996; Amvam et al. 1998).
Identificación de los componentes del aceite
Se realizó un análisis por cromatografía de gases (CG) en dos columnas capilares de sílice fundida HP-5 (columna apolar) 30m x 0.25 d.i., 0.25 µm e INNO-VAX (columna polar) 50 m x 0.25 µm d.i., 0.25 mm, (carbowax 20M). Se utilizó He como gas de arrastre, presión 78 kPa, velocidad lineal 20 cm/min y split 1:30. La temperatura del horno se programó a 50°C (5 min), incrementos de 4.5°C/min, finalmente se mantuvo a 250°C (10 min). La temperatura del puerto de inyección fue de 250°C y de la línea de transferencia 180°C. La energía de los electrones ionizantes fue de 70 eV. La composición química del aceite se determinó mediante CG/EM utilizando un CG Hewlett Packard 5890A Series II en interfase con un detector selectivo de masas HP 5972, conectado en línea a una base de datos NBS75K y Wiley 138 para la identificación espectrométrica de masas de los componentes. Los espectros de masas se obtuvieron por barrido automático dentro de un rango de masas m/z de 30 a 300. Los datos cuantitativos fueron suministrados por autointegración del equipo. Los compuestos se identificaron por comparación de los espectros de masas de cada componente con los estándares de las librerías y con datos registrados en la literatura (Adams 1995; Kondjoyan y Berdague 1996). El tetradecano se utilizó como estándar interno.
Bioensayos
Evaluación de la actividad insecticida
La actividad insecticida del aceite esencial de O. micranthum se llevó a cabo mediante la prueba de toxicidad por contacto. Una hoja de papel filtro Whatman No 1 (10.9 cm de diámetro) se colocó en recipientes de vidrio. Una alícuota de 10 ml del aceite esencial preparado a 100, 125, 150, 175 y 200 ppm (utilizando como solvente una solución etanólica preparada al 1%), se aplicó a cada papel de filtro. El etanol se dejó evaporar durante 10 minutos antes de introducir 10 adultos de M. domestica (5 hembras y 5 machos, alimentados durante dos días). Los recipientes se guardaron separadamente a la temperatura del laboratorio a 24°C y 70% de humedad relativa. Cada tratamiento se replicó tres veces. La mortalidad de los insectos se registró a las 3, 6 y 9 horas. Los insectos se consideraron muertos si permanecían inmóviles y no respondían a tres punzadas con una aguja de disección después de un período de recuperación de 5 minutos. Se utilizó como blanco el disolvente del aceite.
Evaluación de la actividad fungicida
La fungitoxicidad del aceite esencial de O. micranthum se evaluó por la técnica de toxicidad por ingestión en dietas. En cajas de Petri que contenían el medio de cultivo (agar) se dispersaron 500 µl de solución del aceite en concentraciones del 0.5, 1 y 1.5%, disuelto en solución etanólica al 3%. Cada tratamiento se repitió 4 veces utilizando como control la solución etanólica empleada en los aceites. Una porción de 5 mm de diámetro del micelio se transfirió a cada caja de Petri, que contenía el aceite esencial. Las cajas de Petri con su contenido (medio de cultivo y aceite esencial) se sellaron herméticamente y se realizaron lecturas de las áreas de crecimiento micelial a las 72, 96 y 120 horas. El porcentaje de inhibición se calculó mediante la fórmula:
En donde: C = Crecimiento del micelio en la caja de Petri control
T = Crecimiento del micelio en los tratamientos
Se estimaron los promedios (índices de inhibición) para cuatro determinaciones. Con base en un análisis de varianza de una sola vía se comprobó a un nivel de significancia, α= 0.05, que las dosis de aplicación son significativas estadísticamente; es decir, que con base en el estadístico de prueba F (Fisher), asociados a un valor de P < 0.05, se entra a consolidar que las dosificaciones promedio de aplicación son significativas.
Resultados y Discusión
Composición química
La Tabla 1 muestra la composición del aceite esencial de O. micranthum. Se observa que el perfil químico que caracteriza los volátiles de esta especie es Fenilpropanos > monoterpenos > sesquiterpenos. Este perfil corresponde a uno de los 3 encontrados en el estudio de la composición química de 12 especies de albahaca realizado por Viña y Murillo (sometido). En 7 albahacas que evidenciaron este perfil, la canela se reveló como la de mayor contenido en fenilpropanoides.
Composición química del aceite esencial de O. micranthum
Índice de retención de Kovat
no identificado
De la prevalencia de los fenilpropanos, cinamato de metilo (79.8%) y metil chavicol (12.3%), se deduce que la ruta biogenética del aceite es básicamente la del ácido shiquímico y que su quimiotipo es "cinamato de metilo". En un estudio realizado con tres especies de albahaca encontradas en Ibagué, Murillo y Viña (1999) determinaron este mismo quimiotipo para O. americanum, O. basilicum y O. minimum. Adicionalmente, se observa que el contenido de monoterpenos (5.72%) es mayor que el de sesquiterpenos (1.94%), presentándose entre ellos mayor abundancia de terpenos oxigenados (7.3%) que de tipo hidrocarburo (0.36%).
El género Ocimum se caracteriza por la alta variabilidad morfológica y abundancia de quimiotipos; sin embargo, no siempre es posible realizar una correlación estricta entre las características morfológicas y el quimiotipo (Marotti et al. 1996). Establecer la composición química del aceite esencial que posee una planta, más que las características morfológicas de ella, es indispensable para potenciar el uso del vegetal con base en las propiedades de sus componentes. La actividad farmacológica, insecticida o fungicida de los volátiles (aceite esencial) de plantas aromáticas, tales como O. micranthum, tiene poco valor científico si no se ha determinado el quimiotipo (Grayer et al. 1996).
Consecuente con la composición obtenida para O. micranthum, debe esperarse actividad biológica de esta especie vegetal puesto que muchos de los compuestos identificados tales como 1,8-cineol, fenchona, linalol, metilchavicol, óxido de cariofileno, se les conoce como insecticidas y/o fungicidas (Morris et al. 1979; Weaver et al. 1994; Duke 2000). De otra parte, la literatura hace referencia a la bioactividad de gran parte de los terpenos oxigenados, en especial los sesquiterpenos (Mann 1978).
Actividad insecticida
El aceite esencial de la albahaca canela causa mortalidad a la mosca doméstica, observándose que el efecto aumenta proporcionalmente con el incremento de la concentración de aceite (Fig. 1).
Evaluación de la actividad insecticida del aceite esencial de O. micranthum frente a adultos de M. domestica.
La DL50 (Dosis Letal) resultó ser 120.3 ppm, con un intervalo entre 113.3-127.7 ppm y un TL50 (Tiempo Letal) de 6.8 horas. Poca información se tiene sobre el comportamiento de M. domestica en las condiciones ambientales de Ibagué, y del Tolima en general. La actividad del aceite esencial de O. micranthum frente a M. domestica puede atribuirse en general a su composición química y particularmente a los constituyentes mayoritarios, cinamato de metilo (79.8%), metil chavicol (12.3%) y linalol (4.44%), los tres compuestos representan casi el 97% del aceite esencial de la planta.
Se conoce que en un producto vegetal, tal como los volátiles de un aceite esencial, aparecen constituyentes minoritarios que pueden contribuir de manera no despreciable con las características químicas y biológicas. Para el caso de O. micranthum la actividad insecticida podría también atribuirse a los compuestos 1,8-cineol (0.31%), fenchona (0.15%), alcanfor (0.32%), los cuales son conocidos por su actividad biológica; como insecticida se han revelado el canfeno (0.18%) y el alcanfor (0.32%), en tanto que el γ-cacineno (0.18%) aparece con propiedades pesticidales y antialimentarias; el τ-cadinol (0.71%) tiene propiedades antibacterial y pesticida; el óxido de cariofileno (0.59%) se sabe que es insecticida, antitumoral y antialimentario (Morris et al. 1979; Duke 2000).
La acción revelada por esta especie de albahaca pone de manifiesto una nueva fuente de insecticida natural, ecológicamente seguro, económico, de fácil adquisición y de crecimiento espontáneo. Importa mencionar, que alternativamente el aceite de O. micranthum (colectada bajo las condiciones de clima, suelo y temperatura de Ibagué) podría ser una fuente de cinamato de metilo (80%) de gran interés como materia prima en la industria del perfume y alimentaria.
Actividad fungicida
La resistencia natural y versatilidad de F. oxisporum fueron la base para seleccionar un rango mayor de concentraciones (0.5%, 1.0% y 1.5%) que el aplicado para determinar las propiedades insecticidas del aceite esencial de O. micranthum.
El aceite esencial de albahaca canela afectó el crecimiento del micelio de F. oxisporum en todas las concentraciones ensayadas. Aún a la cantidad más baja (0.5 %) el desarrollo del hongo se vio afectado; en 96 horas de acción y a una dosificación del 1.5%, O. micranthum inhibió el crecimiento del hongo en un 75% e impidió su recuperación al aumentar el tiempo a 120 horas (Fig. 2). A las concentraciones de 0.5% y 1.0%, el hongo presentó un desarrollo evolutivo normal en organismos de este tipo (descenso y ascenso, con un máximo de inhibición). No obstante, a la dosificación más alta (1.5%) se nota un estancamiento en el progreso de crecimiento, durante el tiempo de evaluación, dejando ver una influencia significativamente negativa del aceite en el desarrollo micelial.
Actividad fungicida del aceite esencial de Canela en tres tiempos de lectura (horas) y a tres concentraciones diferentes (%) sobre el crecimiento micelial de Fusarium oxisporum.
Teniendo en cuenta la variable tiempo, se revela mayor acción fungicida a las 96 horas en cualquier concentración. En este tiempo de observación, el hongo se inhibió en más del 50% con todos los tratamientos, lo cual deja ver la incidencia de esta variable en el desarrollo del hongo. A una concentración del 1.5% fueron necesarias 96 horas de acción para estancar el crecimiento de F.oxisporum. Entonces, el aceite esencial de albahaca canela inhibe paulatinamente el desarrollo normal del micelio en el tiempo. En otras palabras, el crecimiento micelial de F. oxisporum está determinado por ambos factores de influencia, tiempo y concentración.
La acción fungicida de albahaca canela guarda estrecha relación con los constituyentes mayoritarios de su aceite esencial; no obstante, no debe perderse de vista la posible actividad de algunos de los constituyentes minoritarios; de ellos, al linalol (componente mayoritario) y al 1,8-cineol (compuesto minoritario) se les ha atribuido la actividad fungicida del aceite esencial de algunas albahacas. La estructura química de los tres compuestos mayoritarios aparece en la Figura 3.
Constituyentes mayoritarios del aceite esencial de O. micranthum.
Amvam et al. (1998), cuando correlacionan la composición química de 13 aceites esenciales de Camerún con la bioactividad, mencionan a Tripathi et al. (1985), para quienes la actividad fungicida del aceite esencial de O. gratissimum de origen hindú es atribuible al p-cimeno, linalol, eugenol y citronelol; el propio Amvam y sus colaboradores sostienen que para las especies provenientes de Camerún y para O. basilicum la actividad fungicida es atribuible al linalol, eugenol y 1,8-cineol, entre otros. Sin embargo, el aceite esencial de O. canum no presenta actividad fungitóxica a pesar de su alto contenido en 1,8-cineol (Lis-Balchin et al. 1998, Duke 2000). Podría pensarse que la bioactividad revelada por O. micranthum se debe a un posible efecto sinergístico de sus constituyentes.
De otra parte, Lis-Balchin et al. (1998) correlacionan la actividad biológica con el perfil de composición, encontrando que aceites esenciales con altos contenidos de hidrocarburos monoterpénicos fueron significativamente activos contra bacterias más no contra hongos. Esta observación estaría de acuerdo con los resultados del presente estudio, puesto que el contenido de hidrocarburos monoterpénicos en el aceite es bajo (0.36%) y manifiesta actividad insecticida y fungicida.
Conclusiones
Los volátiles de albahaca canela encontrada en forma silvestre presentan actividad insecticida contra Musca domestica y actividad fungicida contra Fusarium oxisporum.
Ocimum micranthum es una especie rica en fenilpropanoides cuyo constituyente mayoritario es el cinamato de metilo, que determina su quimiotipo.
Ocimum micranthum es una fuente potencial para la extracción de cinamato de metilo, compuesto de gran interés industrial.
Footnotes
Agradecimientos
Los autores agradecen el apoyo económico y logístico del Comité Central de Investigaciones de la Universidad del Tolima y el suministro del material fúngico a CORPOICA-Nataima.