Abstract
Entomopathogenic fungi in Colombia have been covered from the biologic control perspective, and few data come from preserved ecosystems. This research studied Cordyceps, its anamorphs and related strains, which parasitize ants in the tropical forest. In samplings carried out in the Colombian Amazonian foothill (450 600 m, during January and May of 1998) parasitized ants were collected in 100 sq. m (50 sq. m per period) in forest with different perturbation regimes. Litter, scrubs and logs were sampled up to 2 m. The inoculates were obtained from the celoma of parasitized ants or stromata of Cordyceps, and cultured in different potato-dextrosa agar (PDA) and water media, and repeated to different media until sprouting of structures that allowed determination. The Cordyceps species found are C. kniphofioides var. ponerinum with its anamorph Hirsutella stilbelliformis, and C. australis in subfamily Ponerinae ants; C. lloydii var. binata and C. unilateralis in Camponotus sp. (Formicidae: Formicinae) ants; the last species was found related with three anamorphs: Hirsutella formicarum, Polycephalomyces sp. and Tilachlidium liberianum, two Torrubiella species and three strains. In laboratory we obtained the strains Verticillium lecanii and Paecilomyces sp. from sick ants into the same epizootic focus of C. unilateralis. The species, anamorphs and strains of Cordyceps richness in the Putumayo foothill show the germoplasm diversity of the tropical forests and its potential for biological control.
Introducción
Cordyceps es el teleomorfo (forma sexual) de un hongo perteneciente a la división Ascomycotina y considerado como el entomopatógeno más diverso del trópico; sus especies son parásitos obligados que pueden causar epizootias en las poblacio nes de arácnidos e insectos. Junto a este hongo se han encontrado géneros relacionados como anamorfos (forma asexual) en los que se destacan Acremonium, Hirsutella, Hymenostilbe, Paecilomyces, Polycephalomyces, Sporothrix y Verti cillium entre otros, los cuales presentan una gran plasticidad en sus formas y funcionalidad; este pleomorfismo les ha conferido una gran ventaja para dispersar esporas bajo una variedad de condiciones ambientales, lo que ha permitido su experimentación en control biológico (Evans et al. 1988).
El ciclo de vida de Cordyceps en hormigas se prolonga entre 6 y 20 días, iniciándose con la adherencia de la espora a la cutícula; posteriormente, la espora germina y penetra el celoma de la hormiga obligándola a una reducción considerable de su actividad con desplazamientos asincrónicos y erráticos. En las siguientes 24 a 48 horas la hormiga muere y el hongo forma una estructura de resistencia, el esclerocio, en el celoma del insecto. Hacia la etapa final de la patogénesis, dependiendo de las condiciones ambientales, emerge el sinema del anamorfo o el estroma maduro de Cordyceps a través de las uniones del tórax con las extremidades y el pronoto (Evans 1982).
El primer ejemplar de Cordyceps fue registrado por Link en 1833 quien lo halló sobre un adulto de Melolontha melolonthae (Coleoptera) y el cual denominó C. militaris (Fries.) (Mains 1958). En 1941, Kobayasi realizó el tratamiento sistemático completo sobre el género Cordyceps, dando a conocer una diversidad global de 137 especies (Mains 1958) y actualmente se estima que existen 400 especies (Hodge et al. 1998). Entre 1948 y 1950, Mains realizó estudios sobre las especies de Cordyceps de Norteamérica e identificando algunos de los géneros anamorfos de Cordyceps: Hirsutella, Hymenostilbe, Stilbella, Akan tomyces y Tilachlidium. Evans (1974) y Evans y Samson (1982, 1984) fueron los primeros en estudiar la infectividad de Cordyceps en artrópodos y específicamente hormigas en cultivos agroforestales de Ghana y en bosques húmedos tropicales de Ecuador y Brasil, encontrando en hormigas seis especies de Cordyceps y sus distintas variedades (Tabla 1).
Especies de Cordyceps encontradas en hormigas de selvas húmedas de Ghana, Brasil y Ecuador (EVANS 1974, EVANS y SAMSON 1982, 1984)
La patología de insectos en el país se ha desarrollado a partir de insectos enfermos o muertos encontrados en los cultivos, e insectos de cría que son inoculados con las cepas comerciales. Sin embargo, Patiño en 1959 realizó una investigación sobre el control natural ejercido por hongos y bacterias que atacan al insecto Erynnyis ello (Esphingidae: Lepidoptera) plaga en cultivos de yuca en condiciones naturales en un bosque pluvial intertropical. También el ICA, entre 1970 y 1990, investigó sobre los hongos entomopatógenos que habitan naturalmente alrededor de los cultivos encontrando a Cordyceps militaris en larvas de Coleoptera (Rodríguez 1984).
Teniendo en cuenta que hasta el momento en Colombia no se había hecho ningún tipo de muestreo de hongos entomopatógenos de hormigas en ecosistemas naturales conservados, esta investigación se propuso determinar las especies de Cordyceps y sus anamorfos más frecuentes en tres bosques con diferentes grados de disturbio y las cepas de hongos entomopatógenos que a partir de estas especies de Cordyceps y anamorfos se pudieran aislar de la selva tropical del piedemonte Amazónico colombiano (Putumayo).
Materiales y Métodos
Area de estudio
La zona de muestreo esta bajo la jurisdicción del municipio de Villagarzón, vereda Alto Chalhuayaco en el Piedemonte Putumayense (Amazonia colombiana), ubicado entre las estribaciones de la cordillera oriental y el "lomerío amazónico"; a 0°50′54″ latitud norte y 76°47′29.5" longitud oeste, en el piso térmico templado con altitudes entre 450 y 600 m y precipitaciones entre 3800 y 4800 mm, de origen orográfico. El promedio de temperatura anual es 24°C y la humedad relativa posee valores hasta del 90%. Corresponde, según las Zonas de Vida de Holdridge, a "bosque muy húmedo tropical" (Bmh-T). Se estima que el Piedemonte Amazónico posee una de las mayores concentraciones de diversidad biótica en el norte de Suramérica (Halffter 1992) y aun conserva un 80% de su cobertura vegetal natural.
Selección y descripción de los bosques
Los muestreos se cumplieron en 3 tipos de bosque, diferenciados principalmente por el grado de disturbio, condiciones microclimáticas, edáficas, fisiográficas, especies dominantes, estado de la hojarasca, grado de epifitismo y uso actual (Tabla 2).
Caracterización de los tipos de bosques de acuerdo a los parámetros bióticos y abióticos
Muestreo y colecta de hongos para colección
En cada uno de los bosques se ubicaron 50 parcelas de 1 × 1 m al azar para cada época de muestreo. Se colectaron hormigas parasitadas de hongos hasta 2 metros de altura y 10 cm por debajo del suelo. Se revisaron ramas, arbustos, troncos, hojarasca y el envés de las hojas.
En campo, las muestras colectadas se describieron macroscópicamente, se secaron y se conservaron con gel de sílice en cajas pequeñas de cartón. En el laboratorio, se describieron los ejemplares colectados para la identificación taxonómica de las especie de Cordyceps y sus respectivos hospederos. Los cuerpos fructíferos se rehidrataron con KOH al 1% y se realizaron cortes para láminas con tinción de azul de algodón. El material colectado está depositado en seco en la colección entomológica del Instituto de Ciencias Naturales (ICN-MHN), de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá.
Obtención de los inóculos
Se tomaron las muestras de los mejores especímenes de hormigas parasitadas por hongos. El estroma se sembró en agar agua o PDA y se expuso a luz solar para la expulsión de las ascósporas y su posterior germinación. De otro lado, se hicieron cortes transversales del abdomen de la hormiga muerta (Fig. 1) y de allí se obtuvo el inóculo del hongo para sembrar por duplicado en los diferentes medios. Todo este material se conservó en una nevera portátil.
Masa de micelio (esclerocio) en el celoma de una hormiga Camponotus spp. de donde se obtuvo el inoculo del hongo.
En el laboratorio, a partir de los ejemplares sembrados en agar agua y PDA, se aislaron las cepas a 28°C durante 15 días. Una vez aisladas se repicaron en agar avena (OA) para su esporulación y determinación. Las cepas que no esporularon se repicaron en agar CEZAPEK DOX, medio líquido de extracto de levadura y malta (SYMC), agar zanahoria avena y agar CZPDOX-OA hasta conseguir estructuras que permitieran su determinación.
Resultados y Discusión
Especies de Cordyceps anamorfos y cepas parásitas de hormigas
En la época seca se coleccionaron 207 ejemplares de hormigas parasitadas por hongos y en la época lluviosa 661 ejemplares. En ambos períodos los ejemplares colectados de Cordyceps y anamorfos se encontraron en los bosques que presentaban algún régimen de disturbio; por ejemplo el bosque con disturbios naturales (B2) presentó 834 casos de hormigas parasitadas por Cordyceps en 100 m2, mientras el bosque con disturbios antrópicos (B3) tuvo 34 casos de parasitismo en la misma área y el menos perturbado (B1) no presentó hormigas parasitadas por algún hongo entomopatógeno (Tabla 3).
Matriz de presencia y ausencia de las especies de Cordyceps y sus anamorfos en los distintos bosques en los dos períodos climáticos (B1, poco disturbado; B2, disturbios naturales y B3, disturbios antrópicos)
Se encontraron cuatro especies de Cordyceps identificadas, nueve anamorfos y dos ejemplares correspondientes a Gibellula formicarum e Hymenostilbe sp. que no se hallaron junto con alguna especie de Cordyceps (Tabla 4). Cordyceps unilateralis es la especie más abundante en las dos épocas del año; mientras Cordyceps lloydii (Faw.) var binata Evans y Samson, Cordyceps kniphofioides var. ponerinum (Evans y Samson) y Cordyceps australis (Speg) Sacc. se mantienen constantes (Tabla 4). Se puede afirmar que la riqueza de Cordyceps es alta si se tiene en cuenta que se hallaron cuatro especies de las cinco registradas para hormigas en el Neotrópico (Evans y Samson 1982). A continuación se hace una reseña breve de las diferentes especies de Cordyceps, sus anamorfos y cepas.
Especies de Cordyceps y sus anamorfos encontrados en el piedemonte Amazónico Colombiano
Cordyceps unilateralis y sus sinanamorfos (Fig. 2)
Cordyceps unilateralis sobre una obrera de Camponotus sp.
Esta especie produce comúnmente epizootias en la casta de las obreras de Camponotus sp. Andrade (1980) registró un sitio epizoótico en Manaus (Amazonas, Brasil) con 3.500 casos de infección de C. unilateralis sobre Camponotus sp., mientras esta investigación encontró 793 casos en 100 mβ de muestreo en el piedemonte Putumayense. Los registros dados en este trabajo de C. unilateralis para Colombia no son los primeros, Kobayasi (1981) reportó la presencia de esta especie en la quebrada Huitoto, río Caguán en el departamento del Caquetá sobre Camponotus sp.. Evans y Samson (1984) han propuesto la asociación Camponotus - C. unilateralis como la interacción dominante entre hongos y hormigas en el trópico. A pesar de la variabilidad en las tallas de las estructuras sexuales de C. unilateralis, esto no representa un problema taxonómico muy profundo como sí lo son los distintos anamorfos que se encontraron relacionados al estroma o en cercanía de los sitios epizoóticos, esta lista larga de especies asociadas, podrían ser sinanamorfos potenciales de C. unilateralis.
En esta investigación Hirsutella formicarum (Fig. 3) fue el anamorfo con mayor número de hormigas parasitadas, 161 individuos en total. Es muy particular la preferencia de Camponotus asociado a H. formicarum de sujetarse a raicillas epífitas de los troncos, como si probablemente no quisieran ser vistas por sus compañeras o por algún otro depredador. En algunos casos se observaron hasta cinco hormigas entrelazadas por mandíbulas y extremidades, unidas entre ellas por los sinemas del hongo. Este comportamiento se ha explicado como una estrategia altruista de las hormigas las cuales se desvían de las rutas de forrajeo de sus congéneres para no contagiarlas, o en otros casos se trata de hormigas que intentan devorar a sus compañeras como mecanismos de limpieza (Evans y Samson 1984). H. formicarum ya se había registrado como el anamorfo más frecuente de C. unilateralis (Mains 1951; Kobayasi 1981; Evans y Samson 1984). Éste puede crecer directamente sobre los peritecios del teleomorfo y presentar A fiálides y B fiálides (Evans y Samson 1984).
Hirsutella formicarum emergiendo del pronoto de una hormiga Camponotus sp.
El sinema de Polycephalomyces sp. se halló emergiendo directamente del estroma de C. unilateralis o en el abdomen de hormigas infectadas con el mismo hongo. Hasta el momento no se le conocía el teleomorfo a Polycephalomyces y se había considerado como un hiperparásito de Cordyceps sp. Los cuatro ejemplares encontrados en el Putumayo señalan a C. unilateralis como una posible fase sexual de Polycephalomyces; hasta ahora se le conocían cuatro especies en dípteros, coleópteros y lepidópteros y se había encontrado estrechamente relacionado con el género entomopatógeno Stilbella (Hodge et al. 1998). Este registro puede considerarse como el primero sobre formícidos.
Tilachlidium liberianum es muy similar al nivel de forma, tamaño y disposición de las fiálides a las B fiálides de H. formicarum, pero su particular sinema blanquecino e hifas hialinas lo diferencian muy bien de H. formicarum. Esta especie crece directamente del estroma de C. unilateralis o de las uniones de las extremidades de la hormiga. Evans et al. (1988) habían considerado a T. liberianum como anamorfo del género Torrubiella, pero su relación como anamorfo de C. unilateralis no se puede descartar. Los especímenes hallados en el Putumayo proponen a esta especie como anamorfo de C. unilateralis.
Sporotrix insectorum se halló siempre relacionado a C. unilateralis. Fue el segundo más predominante, con 124 individuos. Este hongo mononematoso se registró como anamorfo de Cordyceps por Evans et al. (1988), pero Hodge et al. (1998) cuestionan su carácter de anamorfo de C. unilateralis y lo relaciona con éste como un hiperparásito muy específico. En el Putumayo esta especie se halló frecuentemente asociada al género Torrubiella, el cual es un teleomorfo entomopatógeno de la misma familia de Cordyceps y asociado a éste muy estrechamente. En los 21 ejemplares de Torrubiella sp.1 analizados, los peritécios estaban cubiertos por las células conidiogénicas de S. insectorum y crecían directamente del estroma de C. unilateralis o sobre el abdomen de hormigas infectadas con el mismo. Además, al hacer una correlación de Spearman entre los individuos con evidencias de Sporotrix insectorum y los demás anamorfos de C. unilateralis, se halló una correlación significativamente positiva. Se podría pensar entonces que la asociación Sporotrix insectorum - Torrubiella sp1 es un hiperparásito de C. unilateralis tal y como lo proponen Hodge et al. (1998).
Cepas obtenidas a partir de C. unilateralis
Se obtuvieron seis cepas a partir de especímenes parasitados con Cordyceps unilateralis o alguno de sus anamorfos. En el caso de Paecilomyces fumosoroseus, el inóculo provino de los cuerpo hifales que se encuentran en el interior del abdomen de las hormigas parasitadas con C. unilateralis, donde las posibilidades de contaminación fueron mínimas pues Cordyceps segrega metabolitos secundarios bactericidas como el Cordycepin que permiten la perfecta momificación de la hormiga (Steinkrauss 1994). Este hongo fue obtenido puro desde el mismo momento de su siembra y sus características macroscópicas y microscópicas permitieron una determinación muy definida. Es muy importante resaltar que las cepas obtenidas a partir de hormigas enfermas incubadas en cámaras húmedas, también correspondieron a Paecilomyces sp. y a Verticillium lecanii. Las posibilidades de que estas hormigas se hubieran contaminado en la cámara húmeda son bajas debido a que sólo los hongos entomopatógenos son capaces de degradar quitina y normalmente no son contaminantes ambientales. En otros estudios se han sembrado ascósporas de Cordyceps sp. y en la mayoría de los casos se han obtenido cepas de Paecilomyces, Verticillium y Nomuraea (Evans 1982).
La cepa aislada del sinema de H. formicarum en agar CZP-Dox - Avena corresponde a las características del género Hirsutella, pero en este caso forma fiálides sublageniformes con conidios de dos tipos, esféricos catenulados o mucilaginosos cilíndricos. Esta cepa en agar caseína tendió a formar un acumulado de fiálides en el centro de la caja y luego un halo de bajo crecimiento. Este desarrollo pudiera corresponder a la formación primitiva de un sinema de Hirsutella sp., que responde a las condiciones de laboratorio de esta manera. Los trabajos de Evans y Samson (1984) en la consecución de cultivos puros de los anamorfos de C. unilateralis han sido fallidos, y el resultado actual puede que corresponda a modificaciones hechas en los medios de cultivos con ingredientes naturales y/o al manejo de las condiciones de humedad y temperatura en el laboratorio.
La cepa identificada como Acremonium se obtuvo del estroma de C. unilateralis que poseía más de cuatro cabezas fértiles en su estroma. Este género no es un anamorfo obligado de insectos aunque ha sido hallado señalado como entomopatógeno por Evans et al. (1988) y asociado con Cordyceps sp. y Torrubiella sp. Se cree que la especie de Acremonium fue aislada de C. unilateralis por su capacidad de colonizar quitina sapróbiamente. Existe una cepa aun sin determinar que se obtuvo de los cuerpos hifales del mismo ejemplar de Acremonium y presentó hifas con granulaciones que dieron paso a hifas lisas y a células conidiogénicas con conidios de tamaños del orden de 15 a 20 um; cuando la colonia ha esporulado lo suficiente se torna de color gris. Esta cepa no se logró identificar, pero se sabe que corresponde a los Deuteromycetes del orden Moniliales.
Cordyceps lloydii var. binata (Fig. 4)
Estromas de Cordyceps lloydii var. binata
Fue una de las especies que también se halló parasitando individuos de Camponotus en el Putumayo. Esta especie, que fue la segunda en frecuencia de individuos parasitados después de C. unilateralis, está dividida en dos variedades separadas de acuerdo con su rango geográfico. C. lloydii var. lloydli que se ha encontrado sobre la especie Camponotus abdominalis en las Guyanas, Trinidad y Panamá, se caracteriza por poseer un sólo estroma y tener como anamorfo a Hymenostilbe formicarum (Petch.). La otra variedad C. lloydii var. binata se ha encontrado en pequeñas obreras Camponotus de los bosques Amazónicos y en el piedemonte andino y no se le ha observado anamorfo alguno (Evans y Samson 1984). Esta variedad que se caracteriza por poseer un par de estromas que emergen del cuello fue la colectada en el piedemonte putumayense y está estrechamente relacionada con Cordyceps dipterigena (Berk y Br.) un patógeno común de moscas en los bosques tropicales.
En el laboratorio se obtuvieron tres cepas de C. lloydii var. binata que no se pudieron determinar. La primera se obtuvo de los cuerpos hifales del celoma de la hormiga y su reproducción es por clamidósporas; la segunda se obtuvo del estroma de C. lloydii var binata y se caracteriza por propágulos; y la tercera cepa presentaba una morfología semejante al género Acremonium, pero carecía de los cordones hifales de donde salen las fiálides. No es seguro que las ascósporas de C. lloydii var. binata hayan germinado, pues en estudios anteriores no se ha obtenido crecimiento (Evans y Samson 1984).
Cordyceps kniphofioides var ponerinum (Fig. 5). Se halló atacando hormigas de la especie Paraponera clavata (Ponerinae). Este hongo, que fue descrito por Evans y Samson (1984) en su trabajo de Cordyceps sp. del Brasil y Ecuador, presenta gran afinidad a las especies Cordyceps doiana (Kobayasi.) en la hormiga Dinoponera longipes de Colombia (Kobayasi 1981) y C. unilateralis en Camponotus spp. y Polyrachys sp. (Formicinae). La apariencia similar de esta especie con las dos anteriores que parasitan formícidos comprueba la complejidad taxonómica de Cordyceps sp., aunque se trate de separar por variedades una misma especie de acuerdo con su hospedero, como en el caso de C. kniphofioides var. ponerinae, la variación en la disposición de los peritecios, la forma de los ascos y el tipo de fragmentación de las ascósporas deben entenderse como el intervalo admisible de variabilidad de la especie.
Cordyceps kniphofioides var. ponerinum emergiendo lateralmente del cuello de Paraponera clavata.
En la zona de muestreo fue encontrado el anamorfo de C. kniphofioides, Hirsutella stilbelliformis var. ponerinum, que comprende sinemas en forma de raíces que lo hacen similar al género Stilbella. De este hongo se sembró inóculo proveniente de los cuerpos hifales y se obtuvieron fiálides subuladas similares a las B registradas para H. stilbelliformis var. ponerinum, aunque la colonia macroscópicamente fue muy diferente a las indicadas por Evans y Samson (1982). Esto se podría explicar por la diferencia en la composición de los medios, mientras acá se usó un medio de microelementos como el CZP Dox. Evans y Samson (1982) usaron un medio natural basado en el gusano de la carne. La cepa provino separadamente de dos ejemplares parasitados con C. kniphofioides y uno con H. stilbelliformis; en ambos casos se produjo el mismo tipo de colonia y cepa.
Cordyceps australis (Fig. 6)
Cordyceps australis sobre hormiga Pachycondyla crassinoda.
Es una especie de gran afinidad por Cordyceps mirmecophila (Ces.) en la forma y disposición de los peritecios, ascos y ascósporas, pero difiere de éste en que parasita hormigas de zonas templadas y subtropicales de los géneros Camponotus y Formica (Mains 1940), mientras C. australis parasita hormigas de la subfamilia Ponerinae. En Ghana se halló parasitando a Palthotyreus tarsatus y Megaponera sp. (Evans 1982), mientras en Brasil, Guyana y Ecuador se encontró en Pachycondila crassinoda y Paraponera clavata, las mismas especies recolectadas en el Putumayo. De estos dos únicos ejemplares no se obtuvieron cultivos de ascósporas pues los especímenes estaban inmaduros. Cordyceps australis se ha asociado con el anamorfo Stilbella buquetii var. formicarum (Samson et al. 1982).
Conclusiones
El género Cordyceps en hormigas del piedemonte Putumayense está representado por cuatro especies: C. unilateralis y C. lloydii var. binata que parasitan individuos del género Camponotus (Formicinae) y C. kniphofioides var. ponerinum y C. australis que parasitan individuos pertenecientes a la subfamilia Ponerinae.
Se determinó que C. unilateralis es la especie dominante y se definió como un hongo pleomórfico con varios estados asexuales, sinanamorfos, como lo son Hirsutella formicarum, Tilachlidium liberianum, Polycephalomyces sp., Paecilomyces fumosoroseus, Paecylomyces sp. 1, Verticillium lecanii e Hirsutella sp. 1.
Las cepas obtenidas en laboratorio a partir de C. unilateralis: Paecilomyces fumosoroseus, Paecilomyces sp. 1 Verticillium lecanii e Hirsutella sp. 1 son los organismos con mayor proyección dentro del control biológico de plagas.
La riqueza en especies, anamorfos y cepas de Cordyceps en hormigas del piedemonte putumayense demuestran la diversidad de germoplasma que posee las selvas tropicales y su potencialidad para el control biológico y hace evidente el desarrollo de inventarios de hongos entomopatógenos en los diferentes ecosistemas estratégicos de Colombia, ya sean selvas tropicales bajas o bosques andinos.
Footnotes
Agradecimientos
Este trabajo fue llevado a cabo gracias a la financiación del Fondo para la protección del Medio Ambiente FEN COLOMBIA y al apoyo del Instituto de Ciencias Naturales y el Departamento de Biología de la Universidad Nacional de Colombia. Se agradece a la comunidad indígena Inga residente en la vereda "Alto Chalhuayaco" y a la Corporación Autónoma para el Desarrollo Sostenible Sur de la Amazonia (CORPOAMAZONIA) por su apoyo logístico. Finalmente, un reconocimiento a Edgar Palacios y Fernando Fernández por su colaboración en la identificación de hormigas.