Abstract
This paper shows the use of the biological model Drosophila Melanogaster on the quantification of the insecticide activity of neem extracts. HPLC profiles were determined for the alcohol and ether fractions. The quality and quantity of the metabolites found in both fractions showed significant differences. Fractions of different polarity were tested with the biological model observing a correlation between the inhibition for the puparium-adult change and the increase in the polarity of the neem fraction. The same biological model was used to study the kinetic for the alcohol and ether fractions of the neem extract. The alcohol extract showed a stability up to 6 months at 20°C, 80% humidity and dark conditions. Finally, the Drosophila Melanogaster model was used for a comparative study of the biological activity between different commercial neem extracts.
Introducción
Las técnicas que involucran conceptos de agricultura sostenible, producción ecoló-gica e insecticidas naturales y botánicos son cada vez más recurrentes por parte de los denominados sistemas tradicionales de la producción agrícola (Programa Flor Verde, Asocolflores - Colombia). En consecuencia, el control de calidad sobre estos últimos insumos es una necesidad cada vez más sentida por este tipo particular de usuarios. Dada la condición de "producto natural" la variabilidad de las concentraciones en los principios activos es muy probablemente la característica más preponderante de este tipo de formulaciones; por lo tanto, la eva-luación cuantitativa de dichas formula-ciones se constituye en una prioridad incuestionable y se puede realizar bien sea por técnicas instrumentales o a través de modelos biológicos en términos de su efi-cacia (Veeresham et al. 1998), con miras a incursionar de una manera más rigurosa y competitiva en el actual sistema de produc-ción agrícola para el control de plagas, toda vez que el gran auge de productos natura-les con una atribuida actividad insecticida no es condición suficiente de garantía para la calidad y/o estabilidad de los productos.
De esta manera, la implementación y desa-rrollo de modelos experimentales en la in-vestigación biológica, cuya estructura es suficientemente simple como para poder ser descrita con los recursos conceptuales exis-tentes (Vidart 1983), proporcionan la com-prensión de este tipo de problemas que con las especies clásicas no han podido ser es-clarecidos, llevando implícito la determina-ción y manejo de parámetros involucrados en cada línea de interés como reproducción, fisiología, genética, etología, en aras de que la información generada por un modelo bio-lógico utilizado como herramienta para la evaluación de extractos naturales obligue a pensar acerca de mecanismos que relacio-nan estructura- actividad (Vidart 1983; Bianchi et al. 1978).
Algunos organismos han logrado un per-fil biológico de tal magnitud que le han conferido un verdadero status de mode-los biológicos. Por ejemplo, a partir de las investigaciones clásicas de Morgan y su escuela, los insectos del orden Diptera, pero particularmente especies del géne-ro Drosophila, se han convertido en una fuente de selección para diversos estu-dios, que permiten extrapolar resultados a especies diferentes, toda vez que el pro-ceso de desarrollo es también uniforme, ya que las variaciones específicas sólo afectan las fases del ciclo biológico (Bianchi et al. 1978).
La especie Drosophila melanogaster ha sido un gran aporte, principalmente, para el de-sarrollo de la genética y recientemente para determinar resistencia o susceptibilidad a insecticidas que presentan distintos modos de acción. Es así que se ha demostrado la existencia de un gen en D. melanogaster resistente a insecticidas (JHA) análogos a la hormona juvenil (Ashok et al. 1998) y cierto grado de susceptibilidad a Ciromazina que es un insecticida regulador del crecimiento de los insectos (IGR), permitiendo predecir que si se controlaran poblaciones de insec-tos plaga su resistencia sería mínima (Wilson 1997). Insecticidas organoclorados, cuyo modo de acción es sobre el sistema nervio-so, han permitido comprender la resisten-cia de D. melanogaster conferida por receptores GABA (Bloomquist et al. 1997; Hosie et al. 1995; Stilwell et al. 1995) y re-sistencia a insecticidas organofosforados y piretroides localizada en el gen CYP6A2 del citocromo P450 (Bride et al. 1997; Dunkov et al. 1997; Dunkov et al. 1996).
En el presente artículo se plantea la técnica HPLC como herramienta para una valora-ción cuantitativa y Drosophila melanogaster como modelo, a nivel de laboratorio, que genera respuestas biológicas para el con-trol de procesos de extracción de produc-tos naturales en función de sus modos de acción, control de calidad de formulaciones y eficacia en función del tiempo de estos productos, mediante evaluación de su acti-vidad biológica. De igual manera se consi-deró en el presente al neem (A. indica) como un caso particular, que pese a su gran auge en las últimas décadas no ha tenido gran impacto a nivel de importaciones de formulaciones comerciales ni de produc-ción nacional.
Materiales y Métodos
Colonia de D. melanogaster (Cepa Canton)
Esta colonia es mantenida en el laboratorio del grupo GIEM del departamen-to de Química de la Universidad de Antioquia, de acuerdo con la técnica tradicional en la-boratorios de Genética (Moreno y Zuleta 1973).
Preparación de los extractos de neem
Las semillas de neem se importaron de Re-pública Dominicana y para cada caso, 100g de las semillas secas y molidas, se some-tieron a extracción en soxlhet hasta ago-tamiento, utilizando éter de petróleo, diclorometano, mezcla diclorometano-éter (1:1), etanol, y metanol. Para poseer un parámetro cuantitativo de los diferentes solventes en el caso del sistema extrayente, se partió de una valoración cuantitativa de la polaridad mediante la siguiente ecua-ción (Jaramillo 1987):
Donde: V= volumen
x= polaridad solvente
Al aplicar la fórmula, los extractos evalua-dos presentaron los siguientes valores nu-méricos de polaridad: 0, 1.7, 3.4, 5.2 y 6.6. Los diferentes extractos se emulsionaron con tween 80 para equiparar las solubilidades en agua y se evaluó su actividad insecticida mediante pruebas de inhibición del desarro-llo de D. melanogaster por cuantificación de la relación entre el número de pupas y el número de adultos.
Cromatografía
Para los perfiles croma-tográficos se utilizó un cromatógrafo líqui-do de alta presión (HPLC) marca Gilson con detector de arreglo de diodos (DAD). Colum-na analítica Waters Spherisorb S50DS2 (4.4 x 150 mm). Fase móvil 22:72 (acetronitrilo: agua) y flujo de 1 mL/min.
Bioensayos. Modelo biológico D. melanogaster: eficacia biológica de los extractos de neem de diferentes polari-dades
Para la evaluación de los 5 extractos se seleccionaron concentraciones entre 50 y 200 ppm. Volúmenes constantes de la mezcla de extracto-alimento (15ml) se de-positaron en viales transparentes; finalmen-te, éstos se cubrieron con gasa durante 24 horas. En cada vial, se depositaron tres pa-rejas jóvenes de D. melanogaster y se deja-ron cruzar durante 2 días, al cabo de los cuales se descartaron. A los 6 días, luego de la siembra, se inició el recuento de los esta-dos inmaduros (pupas) hasta el día 13 con intervalos de 3 días y el recuento de los adul-tos a partir del día 10 y hasta el día 20 aproxi-madamente con intervalos de 12 horas y descartes posteriores a las lecturas. Al final de la última lectura se asegura el desarrollo de los individuos de la primera generación filial. Se realizaron 4 réplicas por tratamien-to y los resultados de la relación pupa-adul-to fueron procesados mediante análisis de regresión con el cual se obtuvo una ecua-ción para el extracto más promisorio y la DL50 para el mismo, expresada como una inhibi-ción en la emergencia al estado adulto.
El modelo biológico D. melanogaster: estabilidad de extractos de neem
Con base en los resultados del numeral anterior, se planteó una metodología que permite estudiar la estabilidad de extractos. Para el presente caso se realizó un estudio cinético que consistió en evaluaciones mensuales por 6 meses de un extracto polar de neem al-macenado a 20°C, 80% de humedad relati-va y baja luminosidad.
El modelo biológico de Drosophila melanogaster: valoración de productos comerciales de neem
Con base en la reproducibilidad observada en el modelo, se evaluaron productos comerciales a una con-centración de 2500 ppm, de acuerdo con las dosis recomendadas para campo.
Resultados y Discusión
El primer parámetro comparativo para la valoración de extractos parte del estudio de los rendimientos para la extracción a partir de diferentes solventes orgánicos o mezclas de los mismos. En la tabla 1 se presentan los correspondientes resultados para los di-ferentes sistemas de extracción de las semi-llas de neem.
Rendimiento de los diferentes ex-tractos de neem (A. indica)
Al considerar la viabilidad para una extrac-ción comercial, los rendimientos tendrían que ser confrontados con variables como costo de solventes, riesgos de operación y sobre todo valoraciones cuantitativas (a través de análisis instrumental-cuantificación química- o bien mediante la actividad bio-lógica) que permitan establecer parámetros adecuados para la toma de decisiones con respecto a las condiciones óptimas para las extracciones comerciales, como se descri-birá en las evaluaciones biológicas.
De esta manera en la figura 1 se presenta la confrontación analítica, a través de dos per-files cromatográficos tipo HPLC (técnica a partir de la cual se pueden establecer los valores cuantitativos de los principios acti-vos de extractos naturales) de los extractos de neem (etanólico y etéreo). Claramente se aprecia que existen diferencias significativas entre los dos extractos con respecto a cali-dad y cantidad de metabolitos presentes y que son responsables de las divergencias observadas en la actividad biológica de los extractos como se muestra más adelante.
Comparación de perfiles cromatográficos de neem (A. indica).
Si bien analíticamente es el método más adecuado para la evaluación y comparación de extractos, los costos del equipo y sus requerimientos hacen impráctico el método para la mayoría de usuarios. En contraste, la utilización de modelos biológicos está en capacidad de responder el mismo tipo de preguntas e incluso en el caso donde se pre-sentan efectos sinergísticos o antagonistas, los modelos biológicos como D. melanogaster puede dar conclusiones más adecuadas.
El modelo biológico D. melanogaster: establecimiento de la eficacia biológi-ca de los extractos de neem de diferen-tes polaridades
La actividad de los extractos está relacionada con el contenido de los prin-cipios activos y esta cantidad, a su vez, es una función del sistema extrayente. Bajo esta consideración en la tabla 2 se observan los resultados en términos de la actividad in-secticida expresada como la interrupción del ciclo vital de D. melanogaster, en la transi-ción pupa-adulto y presentada de una for-ma ascendente de acuerdo con la polaridad.
Parámetros evaluados para los extractos de semilla de neem (A. indica) sobre el modelo D. melanogaster
A: adultos
P: pupas
Cuando se observa la actividad de los ex-tractos de semillas de neem, (expresada como una inhibición de la emergencia de adultos en el modelo D. melanogaster en función de la polaridad), se puede generali-zar que los extractos de neem de polaridad 0 o valores cercanos no presentan una ac-ción inhibidora en el paso pupa-adulto, a concentraciones ≤ de 200 ppm. Tal compor-tamiento se puede atribuir a que dicha acti-vidad está mediada por compuestos polares como nimbin, salanim, azadirachtina y 6-desacetilnimbin que son los responsables directos de la acción inhibitoria del creci-miento (Jarvis et al. 1997; Jaglan et al. 1997) al comprometer los niveles hormonales pre-sentes en los estados inmaduros de los in-sectos (Mitchell et al. 1997) evitando que éstos lleguen a su estado adulto.
En la figura 2 se aprecian las diferencias en las respuestas biológicas para los diferen-tes extractos formulados.
Inhibición en el paso pupa-adulto para el modelo Drosophila melanogaster por acción de diferentes extractos de neem (A. indica).
Al considerar el comportamiento de cada tipo de extracto se obtienen las diferentes ecuaciones presentadas en la tabla 3.
Ecuaciones de regresión y DL50 para los diferentes extractos de neem (A. indica)
Con base en los valores alcanzados para los diferentes extractos y los DL50 a partir de los cuales se presentan diferencias altamente significativas, se establece la ecuación de re-gresión basada en la actividad insecticida y traducida como inhibición del paso pupa-adulto del modelo D. melanogaster en fun-ción de la polaridad de los extractos de neem.
En consecuencia de la anterior ecuación se puede afirmar que el empleo de extractos de neem de baja polaridad, tales como los aceites, no son promisorios para su uso como insecticida, (pese a su rendimiento en la extracción (Tabla 1) cuyo modo de acción sea la interrupción en el paso pupa adulto y a las concentraciones estudiadas en el pre-sente artículo, dado que se ha determinado que tales aceites ejercen una marcada ac-ción antialimentaria (Dhar et al. 1996; Weissling et al. 1997)
De otro lado sistemas de extracción de alta polaridad son muy similares en cuanto a la actividad insecticida generada, dada la ten-dencia a formar una asíntota cuando los porcentajes de mortalidad están cercanos al 100%. Bajo estas circunstancias la determi-nación del tipo de solvente a utilizar será más una razón económica o de seguridad, de tal manera que para tener un parámetro cuantitativo de la actividad de un extracto polar de neem, en la tabla 4 se presenta el análisis de regresión para un extracto de polaridad 5.2
La ecuación para el modelo D. melanogaster corresponde a la forma:
A partir de esta ecuación se estimó la DL50 para el extracto de polaridad 5.20 obte-niéndose una concentración de 46.69 ppm.
En consecuencia, este tipo de extracciones garantizan una marcada actividad insectici-da comprometiendo parámetros hormona-les en el paso pupa-adulto, que bien puede traducirse en un control de las poblaciones de plagas en la generación siguiente toda vez que los programas de aplicación de in-secticida en los sistemas agrícolas sean manejados rigurosamente.
El modelo de D. melanogaster: estabili-dad de extractos de neem
Una alternati-va para la realización de estudios de estabilidad de extractos naturales en función del tiempo se puede realizar a través del comportamiento biológico del modelo D. melanogaster. En la tabla 5 se presenta un estudio cinético a 2500 ppm comparativo para dos extractos de neem formulados en tiempos diferentes
En consecuencia, con los resultados presen-tados en la tabla 5 se establece que:
Los productos evaluados el primer día de formulación presentan una actividad óptima.
Ambos productos conservan una activi-dad óptima hasta el día 68 de la formu-lación.
El comportamiento del "producto 2", con respecto al número de pupas observa-do, es significativamente diferente a par-tir del día 68 de formulación. Sin embargo, su actividad insecticida se con-serva.
Para el día 94 el "producto 2" pierde toda actividad insecticida.
El "producto 1" conserva su actividad inmodificable hasta el día 195.
Con base en los resultados de la prueba anterior se puede establecer que el deno-minado "producto 1" presenta una vida me-dia de más de 6 meses, mientras que el "producto 2" debe ser aplicado antes de cumplir 2 meses de formulación.
Modelo D. melanogaster: valoración de productos comerciales
Son varias las al-ternativas para emplear el modelo D. melanogaster como herramienta para la evaluación de las diferentes presentaciones comerciales de extractos: La primera supo-ne la evaluación del producto a la concen-tración recomendada por el fabricante y para tal efecto en la figura 3 se presenta la eva-luación de tres productos comerciales de neem.
Comparación de la actividad en el paso pupa-adulto sobre Drosophila melanogaster de formulados de neem (A. indica).
Tal como se desprende de los resultados, solo el "producto 1" presenta una significa-tiva actividad biológica en función de la in-terrupción en el paso pupa-adulto a las dosis recomedadas.
La segunda alternativa se plantea a partir de la evaluación de un rango de concentraciones de los productos comerciales empleando modelos de regresión tal como los presentados en la tabla 3 y donde la comparación se establece a partir de las DL50.
Modelo de regresión para un extracto de semillas de neem (A. indica) de polaridad 5.20 sobre el modelo D. melanogaster
Prueba de Estabilidad para dos extractos polares de neem
Conclusiones
El modelo D. melanogaster puede ser empleado adecuadamente para definir parámetros en función de la actividad bio-lógica de extractos naturales.
El modelo D. melanogaster representa una alternativa viable para la realización de es-tudios de estabilidad y vida media de extrac-tos naturales con actividad insecticida.
El modelo D. melanogaster puede ser empleado para el control de calidad de dife-rentes presentaciones comerciales de extrac-tos naturales.
Dada la facilidad de manejo y los bajos costos para su mantenimiento a nivel de la-boratorio, el modelo D. melanogaster es una herramienta promisoria en la evaluación de extractos naturales.
Footnotes
Agradecimientos
Los autores agradecen al Comité de Investi-gación (CODI) de la Universidad de Antioquia y a la Universidad Católica de Oriente por la cofinanciación de este proyecto.