Abstract
The entomogenous fungus, Beauveria bassiana, pathogen of the coffee berry borer, Hypothenemus hampei, when growing on SDA or rice rarely produces chlamydospore; however, when SDA and rice were amended with 600, 3000 & 6000 ppm of copper oxychloride, ninety-nine isolates from different insect orders produced an large number of chlamydospores. The chlamydospore cytoplasm of all isolates contain large lipid deposits and vacuoles, mitochondria and endoplasmic reticulum, all typical of fungal cells. The induction of chlamydospores in B. bassiana may be of interest in developing formulations for control of terrestrial insects due to the persistence of this structure. This is the first time that a chlamydospore formation in B. bassiana is reported.
Introducción
La broca de la cereza del café, Hypothenemus hampei (Ferrari), es la plaga más severa del cultivo en Colombia y en la mayoría de países productores de café. El interés en emplear un control alternativo ha aumentado pues el control químico se ha vuelto económica y ambientalmente desfavorable. En Colombia, particular atención ha sido enfocada en el hongo entomopatógeno Beauveria bassiana, que es un patógeno natural de la plaga, además de ser ambientalmente seguro y fácil de producir en masa (Bustillo 1991).
La hembra de H. hampei hace galerías en el endospermo del fruto del cafeto donde pone huevos, durante este evento el fruto puede caer al suelo permaneciendo como una fuente de reinfestación después de la cosecha (Baker et al. 1992). En tiempo seco, se ha encontrado que los frutos del suelo tienen más hembras que los infestados en el árbol. Los factores que influyen en la emergencia de adultos de broca a partir de frutos caídos son la temperatura y la lluvia, asi mismo, evitan condiciones húmedas en el suelo y a hongos como B. bassiana (Baker 1984).
En B. bassiana ni clamidosporas, ni la fase sexual o telomorfo han sido observados (MacLeod 1954, De Hoog 1972, CMI Descriptions 1979). Hay evidencia en la literatura que sugiere que las clamidosporas son estructuras de resistencia que surgen en condiciones adversas, las cuales permiten viabilidad durante considerables períodos de tiempo, teniendo funciones primarias de sobrevivencia; se ha establecido que éstas siempre surgen como una consecuencia de condensación citoplasmática, formándose a expensas de las células hifales vecinas (Langeron y Van Breuseghem 1965).
Carrión et al. (1990) mostraron que Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas cultivado en medios con triadimefon o cobre formaron estructuras resistentes como esclerocios; además, se observaron clamidosporas en Fusarium oxysporum (Schlecht) cuando crecía en una solución de potasio fosfato monobásico y sulfato de magnesio suplementado con glucosa (Qureshi y Page 1970).
Experimentos sobre compatibilidad de B. bassiana con agroquímicos in vitro (Rivera 1993) demostraron que el oxicloruro de cobre permite el desarrollo del hongo, aunque más lento y con una morfología macroscópica diferente. En este trabajo se registra por primera vez y se describe la clamidospora de B. bassiana formada en medios suplementados con oxicloruro de cobre.
Materiales y Métodos
Noventa y nueve aislamientos multiespóricos de B. bassiana de diferente origen geográfico, aislados a partir de diferentes insectos de los órdenes Coleoptera (61), Hemiptera (4), Himenoptera (3), Homoptera (6), Lepidoptera (17), Ortoptera (1) y de origen desconocido (7) pertenecientes a la micoteca de CENICAFE, crecieron en Agar Sabouraud Dextrosa (SDA) acidificado con ácido láctico (0.37%) y arroz, esterilizado al baño María; después de la esterilización, se les adicionó a los dos medios oxicloruro de cobre, en concentraciones de 600 ppm (pH 4.5 y 6.1), 3000 ppm (pH 5.0 y 6.1) y 6000 ppm (pH 5.3 y 6.4), para después inocularlos con los diferentes aislamientos e incubarlos a 25°C por 30 días.
Después de 5-7 días, los cultivos procedentes de los platos de petri (Fig. 1a) o de botellas (Fig. 1b) se tiñeron con lactofenol y se observaron en el microscopio Zeiss Photo Microscope Axiophot. Pedazos pequeños de SDA con el hongo se examinaron bajo el microscopio electrónico de barrido (S.E.M.), usando técnicas estándar (Beckett y Read 1986) con pequeñas modificaciones, en el International Mycological Institute (IMI, Egham, U. K.). La cámara de criopreparación fue enfriada a 190°C y el SEM a -160°C empleando nitrógeno líquido. El especimen fue montado y sumergido en nitrógeno. Cuando las burbujas cesaron, el especimen se puso en el criostato, luego se cubrió con oro y se examinó a 8.6 y 12 KV, usando una distancia de trabajo de 8 mm. Para el microscopio electrónico de transmisión (TEM), pedazos de 3-5 mm de SDA se trataron y fijaron con una solución acuosa de permanganato de potasio al 1.5% (p/v); glutaraldehido al 15% (v/v); acroleína al 2% (v/v) en buffer cacodilato de sodio 0.005 M, durante 25 minutos a 3°C, posteriormente con tetraóxido de osmio al 2% en 0.005 M cacodilato de sodio durante 50 minutos a 3°C. El material así fijado se lavó con 0.005 M de cacodilato de sodio, deshidratado en una serie creciente de alcohol (25-100%) (Griffiths 1973a) y embebido en resina spurr de baja viscosidad (Spurr 1969); luego se seccionó en un Ultramicrótomo Porter Blum 6000 con una cuchilla de diamante obteniéndose cortes de aproximadamente 600 nm de espesor. Las secciones se colectaron en rejillas de cobre (un mesh de diámetro) y se tiñeron con acetato de uranilo (2%) por cinco minutos (Mayor et al. 1961). Las secciones se examinaron por medio de un microscopio electrónico Jeol 100 SX.
Clamidosporas de Beauveria bassiana formadas en SDA (a) y arroz (b) suplementados con oxicloruro de cobre (X 100).
Resultados y Discusión
Todos los aislamientos presentaron gran número de clamidosporas intercalares. Las clamidosporas tienen un tamaño desde 12µ hasta 18µ (Fig. 2) y una pared gruesa y rugosa en comparación con el micelio. La condensación citoplásmica es una característica importante de la formación de clamidosporas, así como el engrosamiento de la pared celular. También se observan grandes cuerpos lipídicos que varían de tamaño y número (Fig. 3).
A pesar de su pared gruesa, con la metodología utilizada, las clamidosporas de B. bassiana se pudieron fijar fácilmente para su observación al microscopio electrónico. La examinación de las micrografías revelan la presencia de muchos componentes típicos de células fúngicas vegetativas tales como: mitocondrias ubicuas, que varían en tamaño y densidad de cresta. Además, el citosol granular contiene una multiplicidad de ribosomas y retículo endoplásmico asociado a cuerpos lipídicos, lo que sugiere que, esta asociación podría estar implicada en la movilización de reservas de lípidos para componentes estructurales durante la síntesis de novo de nuevas membranas o componentes celulares y para la sobrevivencia de la espora en dormancia.
Tal vez la estructura mas sobresaliente de las clamidosporas de B. bassiana es la naturaleza de sus paredes. Alguna controversia ha surgido con el número de capas que constituyen la pared de la clamidospora. En este trabajo se registra una pared con tres capas, compuesta de una cubierta exterior sobre dos capas relativamente gruesas depositadas entre aquella y la membrana plasmática. Algunos autores han propuesto que las capas gruesas internas son en realidad una sola capa. Griffiths (1973b) sugirió que esta capa es frecuentemente mal interpretada como dos capas por sus apariencia estriada o lamelar causada por la fijación, sin embargo, con base en la presente evidencia (Fig. 3), se consideran como capas separadas.
La formación de clamidosporas, inducida por el oxicloruro de cobre, puede ser debida al metabolismo impuesto por el ion cobre. Los resultados sugieren que un compuesto como el cobre en baja concentración, es capaz de inducir formación de clamidosporas en B. bassiana, sin embargo a concentraciones supra óptimas, el cobre es un potente inhibidor del crecimiento fungal y es un componente clave de varios fungicidas. Por otro lado, el cobre es un micro nutriente esencial por su papel como metal activador de varias enzimas fungicas, particularmente oxidasas (Garraway y Evans 1984; Majchrowicz y Poprawski 1993).
La inducción de clamidosporas en B. bassiana podría ser de interés en desarrollar formulaciones para aplicaciones al suelo como un agente biocontrolador contra la broca del café (Prior 1994) por su probable persistencia. Estudios bioquímicos y de patogenicidad deben llevarse a cabo con las clamidosporas de B. bassiana para entender su desarrollo y germinación en el suelo, además, este evento podría explicar la persistencia del hongo en el ambiente en ausencia de insectos.
Clamidospora de B. bassiana formadas en SDA suplementado con oxicloruro de cobre (10 KV).
Clamidospora de B. bassiana mostrando la pared celular trilamelar (CW) y constituyentes protoplasmáticos como retículo endoplásmico (ER), mitocondria (M), ribosomas (R), cuerpos lipídicos (LB) y vacuola (V). (10 K).
Footnotes
Agradecimientos
Los autores agradecen al Dr. P. S. Baker por sus útiles e invaluables comentarios, a S. Rivas (Cenicafé-Colombia) por su asistencia al embeber las muestras y a G. Godwin (IMI-UK) por las fotografías en el microscopio electrónico.