Abstract
In Colombia there are several problems in crops caused by pests. The tropical flora, rich and diverse, offers a great amount of economically significant plants that produce bioactive compounds with insecticidal or other interesting applications. The secondary metabolites, of limited distribution in specific taxonomic groups, which functions are not well known and are identified as allelochemical agents against predators and other microorganisms, have active, selective and specialized properties. The available ethnobotanical knowledge helps to select some species and study them from the point of view of their potential capacity to be applied as natural control agents as part of the Pest Ecological Management (PEM). Looking for natural insecticides of vegetal origin is a meaning research field in order to find out methods for protect the environment and the human health. The extracts in different solvents of the selected parts of the plants were treated through designed bioassays to determine their potential activity. The fractionation guided by bioassay have lead to find and isolate the active fractions. Among the bioassays were used: housefly larvae Contact bioassay (Diptera), Antifeedant Activity assay to Pieris brassicae larvae (Lepidoptera: Pieridae), Phototoxic and General Lethality Test with A. salina. The results are shown in the tables and graphics included. The parameters used were: mean mortality, relative growth rata, morphological and behavior all changes and others.
Introducción
Los insectos fitófagos, conocidos como plagas, causan severos perjuicios en cultivos y cosechas, generando grandes pérdidas económicas como en los casos de la broca del cafe, Hypothenemus hampei (Ferrari) y el picudo del algodonero, Anthonomu grandis Boheman. Las plantas superiores producen numerosas sustancias químicas útiles como alimentos industriales, productos terapéuticos y plaguicidas. Los metabolitos secundarios, de distribución limitada en grupos taxonómicos específicos, y a los cuales se les atribuyen funciones ecológicas y de defensa contra microorganismos y otros depredadores, presentan propiedades bioactivas especializadas. Los extractos de plantas se usan desde la antigüedad por sus notables propiedades insecticidas, repelentes y antiapetentes, tales como los piretroides, rotenoides y limonoides. Se estima que sólo entre el 5 y el 10% de las especies vegetales se han investigado en la búsqueda de compuestos bioactivos, y la mayoría se han probado frente a un único ensayo. La flora tropical, rica y diversa (Correa y Bernal 1990; García Barriga 1975), ofrece recursos muy valiosos de sustancias activas potencialmente útiles, y los insecticidas botánicos se incluyen entre las estrategias del Manejo Ecológico de plagas (MEP), el cual busca proteger la salud humana y el medio ambiente. Dentro de este orden de ideas se inició en el Departamento de Química de la Universidad Nacional de Colombia un estudio orientado a la búsqueda sistemática de insecticidas de origen vegetal y es objetivo del presente trabajo informar algunos de los resultados obtenidos hasta el momento.
Revisión de Literatura
Durante la última década se ha despertado un gran interés en la investigación de insecticidas de origen vegetal, lo cual se refleja en las numerosas revisiones publicadas por Grainge y Ahmed (1988), Jacobson (1989), Adityachaudhury et al. (1985), Sukumar et al. (1991), Bowers et al. (1985) y Vallejo y Sánchez (1992). Entre los productos más promisorios figuran, además de las piretrinas (Elliot 1977), el árbol del neem (Azadirachta indica) y otras Meliáceas cuyas bondades son ampliamente conocidas (Jones et al. 1989) y los cuales se utilizan hoy día a nivel de campo en varios países de Centroamérica y Asia. Estas y otras plantas han mostrado capacidad de afectar el crecimiento y la reproducción de los insectos, como los precocenos de Ageratum sp. (Alkofahi et al. 1989), los cuales interfieren distintos estados de desarrollo de los mosquitos, alterando el ciclo biológico y la oviposición, por inhibición de la síntesis de tripsina. Las especies estudiadas se han seleccionado con base en los siguientes criterios: sus propiedades biológicas y medicinales reconocidas en la información etnobotánica y bibliográfica disponible; ser especies análogas de otras usadas con diversos propósitos en forma tradicional; plantas que presenten escasa herbivoria, así como géneros no estudiados desde el punto de vista fitoquímico; las especies seleccionadas en primera instancia se incluyen en la Tabla 1.
Materiales y Métodos
Muestras vegetales
Euphorbia caracasana es un arbusto de flor blanca pequeña, produce abundante látex blanco, alergénico a la piel y los ojos. Se colectó en Las Guacas, en Timbío (Cauca).
La especie Brunfelsia pauciflora (H. B. K.) es un arbusto abundante en la región tropical occidental de la cordillera de los Andes, se conoce como «ayer, hoy y mañana» por el cambio rápido de coloración que presentan sus flores desde blanco a azul violáceo, y pertenece a la familia Solanaceae, ricas en derivados alcaloidales y muy utilizadas como ornamentales. Hay evidencias sobre el uso de plantas pertenecientes al género Brunfelsia como el primer narcótico utilizado en los altiplanos andinos, según lo reportado por Schultes (1969). Numerosas colecciones en herbarios de Bolivia, Brasil, Colombia y Ecuador indican un amplio espectro de aplicaciones terapéuticas en medicina tradicional, en el tratamiento de dolores reumáticos. La especie B. hopeana aparece reportada en la farmacopea brasilera como narcótico. De este género se han aislado varios alcaloides derivados del tropano, cumarinas como la escopoletina, y es probable que en el extracto metanólico estén presentes alucinógenos y otros constituyentes biodinámicos. Esta planta se ha reportado en varios casos como tóxica para mamíferos por ingestión de semillas y frutos (Banton et al. 1989), produciendo alarmantes síntomas de envenenamiento. Al respecto Lloyd et al. (1985) han informado la presencia de un derivado tipo pirrol-3-carbox-amidina que presenta propiedades convulsivas, el cual fue aislado de las especies B. grandiflora y B. bonodora.
La especie Solanum mammosum L. es un arbusto abundante en suelo acido, es tóxico y sus frutos se usan para eliminar cucarachas y otros insectos de las viviendas rurales. Su flor es morada clara y presenta frutos amarillos en forma de pera.
Las especies Clusia multiflora H.B.K. y Calophyllum brasiliense Camb. son arboles maderables, de hojas gruesas, que producen un látex amarillo o blanco, usado por los indígenas para tinturas rituales y cuyos frutos se usan en medicina tradicional en el tratamiento de la dermatitis. En cuanto a las especies Dalea caerullea (L.F.) Theillung & Schung, conocida como «chiripique», y Cassia tomemtosa Mutis ex L.F.fueron seleccionadas con base en reportes etnobotánicos sobre sus propiedades repelentes de pulgas y otras plagas comunes en viviendas rurales.
Pimienta racemosa es un arbusto de agradable e intenso olor a pimienta, sus hojas producen un aceite de reconocida acción larvicida y no hay estudios sobre su composición química.
Las plantas incluidas en este trabajo se colectaron en los lugares indicados en la Tabla 1 y fueron identificadas por los botánicos Alvaro Cogollo del Jardín Botánico de Medellín, Roberto Jaramillo del Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia y Francisco Sánchez del Jardín Botánico «José Celestino Mutis» de Santafé de Bogotá.
Especies de plantas evaluadas en los bioensayos preliminares.
Preparación de las Muestras
El procedimiento general aplicado a las muestras se indica en el Diagrama A. Las muestras se sometieron a un tratamiento específico para cada especie así:
B. pauciflora: Ramas y tallos de esta planta se colectaron en el Jardín Botánico de Santafé de Bogotá. Una muestra de 358 g, seca y molida, se extrajo con éter de petróleo (EP) (23,5 g) y alcohol metílico en forma sucesiva (12,8 g). El extracto acuoso se preparó en el momento del ensayo por infusión en agua caliente durante 10 minutos de una muestra entera de 50 g y se utilizó directamente.
P. racemosa: Se extrajeron 300 g de hojas con éter de petróleo del cual se obtuvo un aceite (3,4 g); el residuo se trató con metanol, obteniéndose 29,4 g de extracto.
C. multiflora: 150 g de frutos secos se extrajeron con n-hexano, por concentración a presión reducida se obtuvieron 3,5 g de jarabe rojo.
C. brasiliense: Hojas secas y molidas (538 g) se extrajeron con etanol y se obtuvo un extracto alcohólico de 19,7 g.
D. caerulea: 110 g de ramas secas se extrajeron con EP, separándose 2,3 g de extracto apolar y del residuo se obtuvieron 12,0 g de extracto metanólico.
C. tomentosa: 300 g de hojas secas y molidas se extrajeron con EP y se obtuvo un extracto de 9,4 g. Del residuo tratado con metanol se extrajeron 34,8 g.
S. mammosum: 70 g de frutos se extrajeron con alcohol metílico, obteniéndose 3,1 g de extracto.
E. caracasana: 70 g de hojas secas se trataron con EP y metanol separandose 2,7 y 6,7 g de extractos etéreo y alcohólico, respectivamente.
Insectos
Las especies de insectos utilizados se obtuvieron de las siguientes fuentes: las larvas de la mosca casera, Musca domestica L., (Diptera: Muscidae), fueron suministradas por los investigadores de la Estación Experimental de la Cruz, del Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA) V Región, Chile, donde se realiza una crianza masiva bajo condiciones controladas (T=28°C; H.R=90%), con dieta a base de harina de maíz (80%), harina de pescado (5%), albumina de huevo (5%) y sacarosa (10%).
Las larvas de la especie Pieris brassicae (L.) (Lepidoptera: Pieridae), conocidas como «cuncunas», se colectaron en el campo en cultivos de Tropaeolum majus L. (capuchina) y se mantuvieron en el laboratorio en plantas de la misma especie hasta el momento del experimento.
Bioensayos
Bioensayo General de Toxicidad frente a A. salina.
Este bioensayo (BGT-As) es el resultado de múltiples experimentos en busca de pruebas simples y rápidas que permitan detectar actividad farmacológica o tóxica (Meyer et al. 1982). Se seleccionó un diminuto crustáceo conocido como Artemia salina, cuyos huevos se adquieren con facilidad como alimento para peces. Cuando los huevos se colocan en solución salina eclosionan a las 48 horas y las larvas nadan hacia la luz. Se evaluan diversas concentraciones de extractos o compuestos por triplicado, controlándose los niveles de mortalidad o supervivencia a las 24 horas. El procesamiento de los datos permite determinar la LC50 y los intervalos de confianza al 95%. Se ha demostrado que compuestos que presentan actividad tóxica frente a A. salina, correlacionan muy bien con actividades detectadas por otros métodos (Alkohafi et al. 1989).
Bioensayo de Contacto Forzado
Para estos experimentos (BCF-Md) se utilizaron larvas neonatas de la mosca casera colocadas sobre discos de papel de filtro, en cajas de Petri, impregnados con soluciones de distintas concentraciones de los extractos a evaluar. El bioensayo se realiza por triplicado y se preparan controles y blancos. Las cajas de Petri se colocan en cámaras bioclimatizadas, controlando el nivel de mortalidad o supervivencia cada 3 horas inicialmente y cada 12 horas después, para calcular los niveles de pupación y emergencia de adultos. De igual forma se puede evaluar la actividad fototóxica (BFF-Md), realizando el mismo bioensayo, pero exponiendo las muestras a la acción de la luz solar o de una lampara de luz ultravioleta por 2 o más horas, según lo reportado por Proksch et al. (1983).
Bioensayo de Actividad Antialimentaria
Este bioensayo (BAA-Pb) se realizó con larvas de la mariposa blanca P. brassicae mantenidas en ayuno durante 4 horas por lo menos. Estas larvas, de color verde y tamaño entre 2 a 3 cm de longitud, son devoradoras de follaje, en especial de ciertas plantas donde se colonizan como huéspedes. Los extractos a ensayar, en concentraciones conocidas, se asperjaron sobre las hojas de la planta T. majus. En el experimento se colocó una larva por cada hoja fresca, colocada en recipientes con agua; y se determinó el porcentaje de consumo de lámina foliar en un tiempo determinado, en comparación con los blancos y los controles, y se observó cuidadosamente el comportamiento de cada larva.
Separación Cromatográfica
A los extractos que presentaron alguna actividad, según los datos incluidos en la Tabla 2, se les realizó un fraccionamiento por métodos cromatográficos en Capa Delgada (C.C.D.) y en Columna (C.C.), con el objeto de separar fracciones y componentes cuya potencial actividad se evaluó según el Diagrama A. Se utilizó gel de Silice de Merck, con tamaño de partícula de 60 o 70-230 mesh según el caso. Las fracciones apolares oleosas, homogéneas en C.C.D. se analizaron por Cromatografía de Gases (C.G.) y Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas (CG-EM) (Smith et al. 1991).
Actividades observadas para los extractos analizados.
C= Concentración, ppp- partes por millón;+ < 20% de Mortalidad; ++ entre 21 y 50%; +++ > de 51%; ++++ 100% de mortalidad; * prueba no realizada; - resultado negativo. EP = éter de petróleo; MeOH = alcohol metílico; E+OH = alcohol etilico.
Resultados y Discusión
Los resultados preliminares de la potencial actividad insecticida de las especies analizadas se resumen en la Tabla 2. Como se observa, los valores más promisorios en cuanto a niveles de mortalidad se presentan en los extractos metanólicos de D. caerulea, P. racemosa, el extracto en hexano de C. multiflora y los extractos acuoso y alcohólico de B. pauciflora.
En razón a lo anterior se continuó con el estudio de las fracciones activas separadas de cada uno de estos extractos, con el objeto de determinar los componentes bioactivos. En el extracto etéreo de C. multiflora se ha reportado la presencia de compuestos fenólicos derivados de benzofenonas, a los cuales se les adelantan otros bioensayos específicos (González 1986)
Los extractos de B. pauciflora (Bp) presentaron los datos de las Figuras 1 y 2. En la primera se muestran las tasas de mortalidad observadas con los extractos etéreo (Bp-EP, 5%), metanólico (BpMeOH, 5%) y acuoso (Bp-H20, 1%) a las concentraciones indicadas, en el bioensayo de Contacto Forzado con larvas de M. domestica (BCF-Md). No se observa acción larvicida en ninguno de los extractos durante los primeros 3 días del ensayo. Al continuar el experimento y permitir a las larvas completar su desarrollo, los niveles de mortalidad crecen y se observan algunas alteraciones durante el proceso de la emergencia de los adultos, tales como alas vestigiales, alas pegadas al pupario o muerte durante el proceso (Ineztrosa et al. 1987). Los extractos metanólico y acuoso, a las concentraciones ensayadas, presentaron los mayores efectos. En el bioensayo BAA-Pb se observó clara actividad repelente del extracto acuoso, pues las larvas evitaban el contacto y la proximidad de las hojas asperjadas con este extracto, y como la mortalidad en el BCF-Md es alrededor del 30%, es de interés determinar si existe alguna relación entre la concentración y la respuesta de las larvas, como lo indican las alteraciones morfológicas observadas, las cuales disminuyen notablemente el porcentaje de individuos emergentes. La D. caerulea presenta acción pupicida total (Arango 1994).
Actividad insecticida de Brunfelsia pauciflora. Porcentaje de mortalidad de larvas de M. domestica en el bioensayo de Contacto Forzado (BCF-Md), en tres solventes.
Actividad tóxica de especies nativas. Mortalidad de Artemia salina con extractos de plantas nativas en tres concentraciones.
La Figura 2 muestra la relación entre concentración y mortalidad en el Bioensayo General de Toxicidad (BGT-As) con Artemia salina, para los extractos etéreos y alcohólicos de las plantas bajo estudio.
La Figura 3 presenta las tasas relativas de pupación en los extractos etéreos de las plantas indicadas, donde se observa la alteración del ciclo biológico de la M. domestica acelerando o retardando el proceso de muda, lo cual se conoce como efecto xenobiótico.
Efectos xenobióticos. Bioensayo de Contacto Forzado. Tasa relativa de pupación de la M. doméstica frente a los extractos de tres plantas en el BOF-Md.
La Tabla 3 incluye los valores de mortalidad, pupación y emergencia de la M. domestica obtenidos en el bioensayo BCF-Md con los extractos de B. pauciflora, para tres concentraciones y a diferentes tiempos. Un elevado porcentaje de adultos emergentes (45%) presenta serias alteraciones morfológicas, tales como presencia de alas vestigiales, abdómenes modificados y cambios de comportamiento social (reproducción y oviposición), disminuyendo de esta manera los niveles poblacionales según los objetivos. Estos datos fueron evaluados por análisis de varianza, Probits y prueba múltiple de Duncan, la cual clasifica estos extractos en grupo A con D. coerulea diferente al grupo donde se incluyen las demás especies. No se incluyen datos sobre el bioensayo de fototoxicidad por no ser estadísticamente significativos.
Resultados de los porcentajes de mortalidad, pupación, emergencia de adultos e individuos afectados en el BCF-Md, con los extractos de B. pauciflora a tres concentraciones diferentes.
a) =Concentración en ppm; 1 = 1000ppm; 2 = 500 ppm; 3 = 100 ppm
Conclusiones
El análisis de los resultados preliminares muestra la presencia de bioactividad en algunos de los extractos de las plantas estudiadas.
Para la especie B. pauciflora, una revisión de sus efectos sobre vertebrados sugiere no recomendar su uso como insecticida.
Para la especie D. coerulea se observa acción pupicida (Arango 1994) y su estudio se continua en ensayos a nivel de invernadero y campo.
Otros efectos observados incluyen acción repelente e inhibitoria del crecimiento como las más relevantes, lo cual sugiere continuar, por medio de separaciones cromatográficas guiadas por bioensayos, la búsqueda sistemática de los componentes activos, cuya existencia se infiere de los datos reportados.
Footnotes
Agradecimientos
Se agradece el apoyo financiero del IPICS de Uppsala (Suecia), de Colciencias 008-94 y del Cindec (UN-803209).