Abstract
Fourteen isolates of Metarhizium anisopliae were tested for patogenicity on adults of the coffee berry borer, Hypothenemu hampei under laboratory conditions (T=25 ± 3°C, R.H.=90%) using a concentration of 1 × 107 conidia/ml. All the tested isolates were pathogenic against the borer, however their virulence was variable. Mortality fluctuated between 32.5% for isolate Ma 9211 to Ma 9101. Average time of mortality after 8 days was also variable with a minimun of 3.4 days for Ma 9101 an a maximun of 5.7 days for Ma 9107. Field trials in coffee plantations were carried out with isolates Ma 9108, Ma 9003 and Ma 9101, which in a laboratory pathogenicity tets all reached more than 84% mortality. A dose of 1.5×108 conidia/branch of 50 berries was evaluated with every isolate. Mortality varied from 31.1% for Ma 9108 to 43.1% for Ma 9101, however no significant differences were detected (P=0.05) between isolates. This study reports for the first time the effect of M. anisopliae on coffee berry borer populations under field conditions and the importance of isolate selection of entomopathogens before considering them in a biological control program.
Introducción
La broca del café, Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Scolytidae), es un insecto muy difíci de controlar, y para reducir sus poblaciones a niveles que no causen daño económico se debe recurrir a diferentes formas de control. El control biológico, mediante el uso de hongos entomopatógenos, es un complemento importante en un programa integrado de esta plaga (Bustillo et al. 1991).
El hongo Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin (Hyphomycetos) puede ser un factor importante para el control de la broca del café. Recientemente fue aislado de adultos de la broca provenientes de frutos colectados del suelo, en un cafetal de la localidad de Amalfi (Ant.), lo que constituye el primer registro sobre la broca en cafetales donde no se han realizado aspersiones del hongo 2 . M. anisopliae se ha registrado atacando una amplia variedad de insectos considerados como plagas de importancia comercial. Se ha encontado en más de 200 especies de insectos en siete órdenes, de los cuales los coleópteros son los más comúnmente atacados (Veen 1968). El hongo se caracteriza por presentar conidióforos que forman capas de esporas, las cuales se producen en cadenas basipétalas compactas en columnas, de forma ovoide a cilíndrica y unicelulares (Bustillo 1987). Se encuentra en forma saprofítica en el suelo y como parásito en insectos (Barret y Hunter 1972). En Colombia su presencia se ha comprobado en 22 especies de insectos, especialmente en el grupo de las chisas (Coleoptera: Scarabaeidae) (Bustillo 1987; Hernández y Rodríguez 1992). M. anisopliae tiene una gran afinidad por insectos del suelo (Zimmermann 1992). Este hongo se ha producido en sustrato de arroz mediante un procedimiento artesanal en Brasil (Alves 1986), Venezuela (Probioagro 1991) y Costa Rica 3 , para el control de cercópidos plagas de la caña de azúcar.
Ruiz S., L. L. Comunicación personal. Disciplina Entomología, CENICAFE, Chinchiná
Hernández Ramírez, J. 1983. Comunicación personal. Ministerio de Agricultura y Ganadería, Subdirección de Investigaciones Agrícolas, Departamento de Entomología. San José de Costa Rica. Mayo de 1993.
El efecto de M. anisopliae sobre H. hampei sólo se ha estudiado bajo condiciones de laboratorio en Brasil (D'Antonio y Paula 1979; Lecuona et al. 1986); sin embargo, estos estudios no han tenido continuidad. Esta investigación tiene como finalidad evaluar la patogenicidad de 14 aislamientos de M. anisopliae bajo condiciones de laboratorio y seleccionar los mejores para evaluarlos bajo condiciones de campo.
Materiales y Métodos
Evaluaciones en Laboratorio
Los estudios de patogenicidad se llevaron a cabo durante 1992 en un laboratorio en Ansermanuevo (Valle) (T=25 ± 3°C; H.R.=90%). De un total de 52 aislamientos del hongo, obtenidos de diferentes partes del mundo y mantenidos bajo refrigeración en medio Sabouraud Dextrosa Agar (SDA), 14 fueron escogidos (Tabla 1) teniendo en cuenta que fueran representativos de varios órdenes y especies de insectos, para evaluar su patogenicidad sobre adultos de la broca bajo condiciones de laboratorio. La concentración de conidias usada para las evaluaciones del hongo fue de 1 × 107 conidias/ml en suspensión acuosa + Tween-80 al 0,1%. Las brocas se obtuvieron de la Unidad de Cría de Parasitoides, procurando que fueran activas y recién emergidas.
Origen de los aislamientos de M. anisopliae evaluados contra la broca del café. Chinchiná, 1992.
Col: Coleoptera; Hom: Homoptera; Lep: Lepidoptera.
Aislamiento CENICAFE
Aislamientos provenientes del IMI (Instituto Micológico Internacional)
Aislamientos provenientes del CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical)
El experimento se organizó en un diseño completamente aleatorio, con cuatro repeticiones por tratamiento. Cada repetición estuvo constituida por 10 adultos hembra de la broca. La unidad experimental consistió de un vial de vidrio de 1,5 cm de diámetro y 6 cm de alto, el cual contenía en su base una rodaja de papel filtro húmedo y como tapa una mota de algodón (Fig. 1). Los insectos se desinfectaron superficialmente con hipoclorito de sodio al 0,5% durante 10 minutos. Posteriormente se adicionó agua destilada estéril para remover el exceso del desinfectante, colocando los insectos sobre papel toalla estéril para la absorción del agua remanente. Una vez desinfestados, se sumirgieron durante dos minutos en la suspensión de conidias de M. anisopliae, y posteriormente fueron colocados en forma individual en cada uno de los viales. Los insectos se seleccionaron tomando los que mayor vigor presentaron después de la inmersión en las suspensiones conidiales. Al cabo de 24 horas se adicionó al recipiente un grano de café pergamino seco, con aproximadamente el 45% de humedad. Se llevaron registros diarios sobre mortalidad y desarrollo del hongo sobre los insectos durante 10 días. Las evaluaciones se hicieron con la ayuda de un estereo-microscopio, para así corroborar la mortalidad causada por M. anisopliae al observar sus estructuras sobre el cuerpo de los insectos.
Recipientes utilizados para conducir las evaluaciones de patogenicidad de M. anisopliae sobre adultos de H. hampei
Evaluaciones en Campo
Los ensayos de campo desarrollados en la Subestación Experimental «Rafael Escobar», en el municipio de Supía (Caldas), caracterizada por tener 22°C de temperatura promedia y 78% de humedad relativa, 1.320 msnm y una precipitación anual de 1.703 mm. Se utilizó un lote comercial de café variedad «Colombia», con aproximadamente seis años de edad, sembrado a 1,50 × 1,80 m. Los aislamientos utilizados en el campo fueron los que presentaron porcentajes de mortalidad mayores al 84% en la prueba de laboratorio. El hongo M. anisopliae para las pruebas de campo se obtuvo a partir de brocas infectadas en laboratorio, que se aisló en SDA, para luego cultivarlo en un medio en base de arroz. Al cabo de 15 días, se procedió a suspender las conidias en 10 ml de un aceite emulsificante (Carrier), adicionado en forma gradual 500 ml de agua destilada estéril, para posteriormente hacer un tamizado y obtener así la suspensión madre de conidias, la cual mediante diluciones sucesivas se ajustó a la concentración necesaria para realizar las aspersiones. La concentración utilizada para los tres aislamientos seleccionados fue de 1 × 107 conidias/ml, asperjando 15 ml/rama de 50 frutos para una dosis de 1,5 × 108 conidias/rama.
El experimento se organizó bajo un diseño completamente aleatorio conformado por cuatro tratamientos (tres aislamientos del hongo y un testigo) y 10 repeticiones. La parcela experimental fue una rama del tercio medio del árbol, a la cual se le dejaron 50 frutos de una edad aproximada de 120 días.
El hongo se asperjó con una bomba Calimax 10 experimental a 40 lb/pulg2 y una descarga de 200 cm3/min. Las aspersiones se hicieron 24 horas antes de la infestación. Las ramas se infestaron con brocas adultas extraidas de frutos de «guayabo», usando una proporción de dos brocas por fruto, dentro de una «manga entomológica» para evitar el escape de los insectos. Los árboles que sirvieron para las parcelas se aislaron, usando como borde cuatro surcos en todas las direcciones.
Las evaluaciones se realizaron ocho días después de la aspersión, cortando y transportando las ramas con la manga entomológica al laboratorio para registrar la mortalidad de la broca causada por M. anisopliae. Se evaluaron tanto los adultos encontrados en el interior como en el exterior de los frutos. La confirmación de la mortalidad por el hongo se verificó al observar la esporulación del hongo en una cámara húmeda.
Resultados y Discusión
Todos los aislamienos evaluados bajo condiciones de laboratorio fueron patogénicos a H. hampei. Los niveles de mortalidad variaron desde 3,5% hasta 95%; cuatro aislamientos causaron niveles de mortalidad superiores al 84%. El tiempo en el cual se produjo la muerte a los insectos fue relativamente corto, variando entre 3,4 y 5,7 días (Tabla 2). Esta mortalidad muestra la importancia de establecer una selección de aislamientos antes de iniciar un programa de control biológico con un entomopatógeno no evaluado.
Mortalidad de Hypothenemus hampei y tiempo promedio de mortalidad por Metarhizium anisopliae en laboratorio (T=25°C; H.R.=90%). Chinchiná, 1992.
Promedios seguidos por la misma letra no presentan diferencias significativas al nivel de P=0,05 según la prueba de Tukey.
El aislamiento denominado Ma 9216, obtenido de O. rhinoceros, identificado como M. anisopliae var. major y el Ma 9206 obtenido de A. reducta e identificado como M. anisopliae var. minor mostraron un desarrollo más lento y poca esporulación sobre las brocas muertas, a diferencia del resto de los aislamientos, cuya esporulación fue abundante (Fig. 2).
Aspecto de un adulto de la broca del café infectado por M. anisopliae.
A pesar de que existen registros sobre la alta patogenicidad de aislamientos de M. anisopliae sobre un insecto en particular (Fargues y Robert 1976, 1978: Fargues y Remaudiere 1977), los resultados de este estudio indican que no son tan específicos, aunque su virulencia hacia la broca fue variable. Este efecto es de interés en el ecosistema cafetero, ya que podría también jugar un papel importante en el control de otras plagas del suelo como las chisas.
En la prueba de campo se evaluaron los aislamientos Ma 9101, Ma 9003 y Ma 9108, con los que se obtuvieron mortalidades superiores al 84% en la prueba de patogenicidad en el laboratorio. La mortalidad causada sobre la broca del café varió entre 31,8 y 43,1%, sin encontrar diferencias significativas entre los tratamientos (P=0,05) (Tabla 3). Los aislamientos guardaron el mismo orden de eficacia que el obtenido en la prueba de laboratorio, aunque con niveles menores, lo cual se puede explicar por el efecto adverso de condiciones abióticas sobre el hongo en los cafetales. La infección de M. anisopliae fue evidente tanto en los adultos de broca que alcanzaron a penetrar el fruto, como en las brocas que se encontraron por fuera, indicando lo anterior que su efecto es bastante rápido, pudiéndose lograr, con aspersiones oportunas, que alguna parte de la población de la broca expuesta al hongo no cause daño al fruto.
Mortalidad promedia de adultos de la broca del café, H. hampei, causada por M. anisopliae bajo condiciones de campo, ocho días después de la aspersión. Subestación Experimental «Rafael Escobar». Supía (Caldas), 1992.
Promedios seguidos por la misma letra no presentan diferencias significativas al nivel de P=0,05, según la prueba de Tukey.
Los insectos infectados por M. anisopliae presentaron un crecimiento blanco compacto, el cual se puede confundir con el presentado por Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. (Hyphomycetos); sin embargo, éste se torna de color verdoso al momento de la esporulación.
Los anteriores resultados indican que M. anisopliae es un agente de conrol biológico de H. hampei, que se puede introducir en condiciones de campo para que contribuya a reducir sus poblaciones en un programa de manejo integrado. Es posible que dadas las características de sobrevivencia de este hongo en el suelo, se pueda también utilizar para controlar la broca que emerge de los frutos caídos que se encuentran en el suelo.
Footnotes
Agradecimientos
Al Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) y al Instituto Micológico Británico (IMI), por el suministro de algunos aislamientos de M. anisopliae.