Abstract
A newfeeding system for rearing cercopids on accessions of Brachiaria spp. was developed to study the etfect of substances supplied to the plant roots in a hydroponic arrangement. The system consisted of a mylarcylinder inserted into a polycarbonate test tube. The mylar cylinder enclosed the root system of a grass plant and provided a feeding chamber for the cercopid nymphs. The system developed resulted in excellent survival, development time, and dry weight of adults of A. varia compared with A. varia reared on susceptible accessions of Brachiaria spp. in a glasshouse. It was demonstrated that the cercopid can ingest substances translocated by the plant xylem. Ecdysone (20-hydroxyecdisone) was administered in solution to the roots of B. ruziziensis CIAT 654. At 50 ppm, ecdisone stimulated the molt of IV instar nymphs within 24 hours. At 100 ppm, ecdisone caused the death of all nymphs and several were malformed. Juvenile hormone (JH-III) at 100 ppm did not have a significant effect on development of A. varia.
Introducción
Especies de cercópidos conocidas como "salivazo" o "mión de los pastos" (Homoptera: Cercopidae) son el mayor limitante biótico en la utilización de gramíneas forrajeras del género Brachiaria en América tropical. Fuentes de resistencia (antibiosis) en Brachiaria spp. a cercópidos han sido identificadas y caracterizadas por medio de un bioensayo que utiliza plantas sembradas en macetas e infestadas con el insecto (Ferrufino y Lapointe 1989; Lapointe et al. 1992). La resistencia se expresa por una reducida supervivencia de las ninfas. Además, en algunas accesiones como B. brizantha cv. Marandú, se presentan una prolongación del período ninfal y una disminución del peso de aquellos adultos que alcanzan a emerger. Sobre ciertas accesiones de B. jubata, el insecto presenta malformaciones asociadas con la muda (Lapointe et al. 1992).
Para dilucidar los mecanismos de antibiosis hacia cercópidos presentes en plantas resistentes, se propuso desarrollar un sistema de alimentación que permita la fácil observación y manipulación de las ninfas durante su desarrollo y el control de nutrimentos u otros factores que podrían ser administrados a la planta. Este artículo describe una técnica para criar ninfas de Aeneolamia varia (Fabricius) sobre raíces de plantas en un sistema hidropónico. Para probar la hipótesis de que sustancias administradas a la planta por medio de una solución hidropónica puedan tener efecto sobre ninfas de cercópidos que se alimentan del xilema de la planta, se probó el efecto de la ecdisona (20-hidroxyecdisona) y de la hormona juvenil (JH-III) sobre el desarrollo de ninfas de A. varia.
Materiales Y Métodos
Descripción general de la unidad del bioensayo
La unidad tal como se muestra en las Figuras 1 y 2, consiste en una planta de Brachiaria sp. sembrada en un cilindro de acetato y sostenida por arena de cuarzo estéril en la parte superior. En la parte media del tubo se colocan un par de espumas plásticas separadas 2,5 cm para formar una cámara donde se ubican ninfas de A. varia para que se alimenten de las raíces que atraviezan la cámara y que llegan a la base del cilindro. Esta unidad se coloca dentro de un tubo de ensayo de policarbonato. En el fondo se añaden 15 cc de agua, de solución nutritiva, o de la sustancia a evaluar. La planta absorve sustancias por las raíces y el insecto las adquiere al alimentarse de los vasos del xilema. El efecto sobre el insecto se cuantifica midiendo la duración de cada uno de los instares ninfales y la supervivencia al estado adulto.
Descripción de la técnica
Se utilizó un cilindro de acetato tipo "mylar", el cual no es tóxico para insectos, de 12 cm de largo por 2.6 cm de diámetro. Los primeros 3 cm del cilindro se llenaron con arena de cuarzo esterilizada y allí se colocó una planta de B. ruziziensis CIAT 654, de 15 días de edad, con una longuitud de raíces entre 10 y 12 cm Inmediatamente debajo de la arena se colocó la primera espuma plástica que forma la cámara donde se aloja el insecto. Se dejó un espacio de 2,5 cm y se colocó la segunda espuma. Las raíces de la planta se colocaron a través de las espumas plásticas para proporcionar los sitios donde se han de fijar las ninfas. Para permitir la manipulación de los insectos se hicieron dos perforaciones laterales de 2 cmβ, y estas se cubrieron con otro cilindro removible del mismo material.
La unidad anterior se introdujo en un tubo de ensayo de policarbonato, de 16,5 cm de largo y 3,0 cm de diámetro. A este tubo se le conectó una manguera plástica de 0,3 cm de diámetro que permitió burbujear aire a baja presión hasta el fondo del tubo para estimular el crecimiento radicular y mantener una temperatura constante (Fig. 1). La manguera se conectó a un compresor de aire a baja presión (80 psi) y a un filtro de carbón activado para evitar la contaminación. Después de pasar el filtro, el aire pasó por un doble serpentín (tubo largo enroscado para el enfriamiento de la destilación) que permite que el aire tome la temperatura del agua corriente que lo irriga. En esta forma, el burbujeo del aire por los tubos mantuvo dentro de los tubos una temperatura constante de 27°C. Diez unidades experimentales compuestas por cilindros de acetato dentro de los tubos de policarbonato se colocaron en una gradilla de madera de 16 cm de alto por 51 cm de largo y 6 cm de ancho que los cubrió completamente (Fig. 2). La gradilla se pintó de negro en su interior para proporcionar la oscuridad necesaria para el desarrollo radicular. Las paredes laterales de la gradilla son removibles y permiten la observación de los insectos. Cada gradilla estuvo conectada por mangueras plásticas al sistema central de aireación (Fig. 2).
Dibujo esquemático de la unidad experimental y sus componentes.
Gradilla con 10 unidades experimentales instaladas al sistema de aireación. Las paredes laterales estan removidas para facilitar la observación.
Diseño experimental
Se utilizaron plantas de B. ruziziensis CIAT 654, un material muy susceptible al ataque del salivazo. La propagación se hizo empleando material vegetativo proveniente de parcelas mantenidas en CIAT, en Palmira (Valle). Los tallos traídos del campo se trataron con una solución de dos fungicidas (ethilenebisdisthio carbamato y benomyl al 2%) durante 5 minutos. Posteriormente se colocaron en un tubo de ensayo de policarbonato con 80 ml de solución nutritiva hidropónica (Coljap Industria Agro-Química S.A., Bogotá) con 2 y 5 ml por litro, de elementos mayores y menores, respectivamente, durante 15 días hasta que las raíces alcanzaron una longuitud de 10 a 12 cm Durante los experimentos, la nutrición de las plantas se hizo cada tres días aplicando 1 ml de la solución nutritiva en la base de los tallos.
Los experimentos se realizaron en un invernadero de vidrio, en la estación del CIAT, en Palmira. La temperatura promedio fué de 24,8± 1,2°C. y la humedad relativa del 92± 2%. En todos los experimentos se usó un diseño completamente al azar con 10 repeticiones.
Se midió la duración de los instares ninfales, la supervivencia del estado adulto y el peso seco de los machos y las hembras que emergieron. La infestación y evaluación diaria de los tubos se realizaron en una cámara de aislamiento. Se hicieron evaluaciones morfológicas sobre las ninfas que murieron, para detectar anormalidades. Los datos se sometieron al análisis de varianza (SAS 1982) y la prueba de rangos multiples de Duncan (Duncan 1955).
Experimento 1
Cada una de las 22 unidades experimentales (tubos) se infestaron con un huevo de A. varia próximo a eclosionar. La supervivencia y la duración de los instares ninfales y la supervivencia del adulto en los tubos se comparó con los resultados de la cría de A. varia sobre accesiones susceptibles de Brachiaria en materos en el invernadero, de acuerdo con la metodología descrita por Lapointe et al. (1989b).
Experimento 2
Esta prueba se realizó para determinar el efecto de dos hormonas involucradas en el proceso de muda: la hormona de la muda (20-hidroxiecdisona) y la hormona juvenil (JH-III), las cuales se obtuvieron de Sigma Chemical Co., U.S.A.. De la 20-hidroxiecdisona se probaron cinco concentraciones (0,05-0,5-5-50 y 100 ppm) y la hormona juvenil se probó a 100 ppm. Cada tubo se infestó con un huevo de A. varia. Cuando las nínfas mudaron al tercer estadío, se colocaron las soluciones de hormonas o, en el caso de dos testigos, agua destilada. Por cada tratamiento se emplearon 10 tubos, para un total de 80 ninfas de A. varia.
Resultados Y Discusión
La duración de los instares ninfales de A. varia en el nuevo bioensayo fué similar a la obtenida en plantas en materos. Sobre B. ruziziensis CIAT 654 en tubos, se obtuvo un 100% de supervivencia con una duración ninfal de 33.1 ± 1.4 días. En materos, la duración ninfal sobre B. ruziziensis CIAT 655 fué de 36,9± 2,9, sobre B. decumbens CIAT 606 fué de 31,9± 1,7, у sobre B. dictyoneura CIAT 6133 fué de 36,7± 2,4 días.
El peso de hembras de A. varia criadas en los tubos fué de 8,8± 1,5 mg y el de machos fué de 5,0± 0,7 mg. En materos, el peso de hembras y machos criados sobre B. decumbens CIAT 606 fué de 8,2±1,2 y 4,9± 0,8 mg, respectivamente; sobre B. dictyoneura CIAT 6133 fué de 6,9±0,7 y 4,5±0,9 mg; y sobre la variedad resistente B. brizantha cv. Marandú fué de 5,7± 0,9 y 3,8± 0,4 mg.
La buena sobrevivencia, la rápida tasa de desarrollo y el alto peso de A. varia criado en los tubos indicaron que el nuevo sistema de alimentación provee condiciones indicadas para la cría del insecto desde huevo hasta adulto con baja mortalidad y un crecimiento normal.
La hormona de la muda, ecdisona, disminuyó la duración del cuarto instar en todas las concentraciones utilizadas (Tabla 1). A la concentración de 50 ppm produjo la muda de cuarto a quinto instar de todas las ninfas expuestas en menos de 24 horas. La ecdisona a 0,05; 0,5; 5,0 у 50 ppm no tuvo efecto sobre la duración del quinto instar. La emergencia de adultos expuestos a concentraciones de 0,05; 0,5; y 5,0 ppm de ecdisona fué similar a la del testigo. Hubo una tendencia a mayor mortalidad (50%) en adultos expuestos a 50 ppm de ecdisona. La ecdisona a 100 ppm resultó en la muerte de todas las ninfas y produjo deformaciones en siete de las diez ninfas. Se observaron dos tipos de deformaciones. En cinco casos, la ninfa murió durante la muda con la exuvia abierta pero sin poder emerger. En dos casos, la ninfa murió con los estiletes abiertos y torcidos y por lo tanto no fué capaz de alimentarse.
La hormona juvenil no tuvo efecto significativo sobre la duración del cuarto y quinto instar, por lo menos a la concentración de 100 ppm. Sin embargo, de las dos ninfas muertas, una mostró los estiletes torcidos, y la otra murió durante la muda, con deformaciones. En ningún caso se observó deformación en los testigos (agua).
Aparentemente, la ecdisona estimuló la iniciación del proceso de la muda antes de que la ninfa estuviera fisiológicamente preparada, resultando en deformación y muerte. En este ensayo, el objetivo no fué estudiar en detalle el efecto de hormonas, sino demostrar que una sustancia suministrada a las raíces de la planta en el nuevo sistema de alimentación, puede ser ingerida por el insecto y tener un efecto sobre su desarrollo. Con esta información, será posible iniciar trabajos de mecanismos de resistencia utilizando el bioensayo descrito.
Efecto de 20-hidroxiecdisona y la hormona juvenil sobre la sobrevivencia y duración del cuarto y quinto instares ninfales de A. varia. Barras son desviación estandar (N=10).
En cada columna, los promedios seguidos por la misma letra no defieren significativamente (Prueba de Duncan, 0,05).
Un solo dato.
Conclusiones
Se desarrolló una metodología que permite evaluar la respuesta de cercópidos a sustancias conocidas para estudiar los mecanismos de antibiosis de accesiones de Brachiaria. La unidad permite la observación directa del insecto durante su desarrollo sin tener que perturbarlo.
La sobrevivencia, la duración de los instares ninfales y los pesos de adultos de A. varia producidos por el bioensayo en tubos fueron.excelentes, equivalentes a los obtenidos en la cría de A. varia sobre accesiones susceptibles de Brachiaria spp. en materos bajo condiciones de invernadero.
Se demostró que las ninfas de A. varia pueden obtener sustancias que la planta trasloca a través de los vasos del xilema. Ecdisona a 50 ppm, suministrada en solución a las raices, estimuló la muda en las ninfas de IV instar que se alimentaban sobre la planta. A 100 ppm, la ecdisona causó la muerte de todas las ninfas y produjo malformaciones en algunas de ellas. La hormona juvenil a 100 ppm, suministrada a las raíces, no presentó un efecto marcado sobre el desarrollo de las ninfas de A. varia.
Se propone usar el sistema descrito para buscar componentes activos en extractos de accesiones resistentes de Brachiaria hacia cercópidos.