Abstract
By means of a backcross breeding program, high levels of resistance to the Mexican bean weevil, Zabrotes subfasciatus (Boheman) (Coleoptera: Bruchidae), were transferred from wild bean accesions to bean cultivars. Four variants of arcelin, the antibiosis factor, showed differential effects on the biology of the insect. Thus, arcelin 1-derived lines were highly resistant to the weevil with a level of resistance equal to that of the resistant check. Arcelin 2 lines were intermediate, while lines obtained from crosses with arcelin 3 and 4 were susceptible. Resistant lines were coded RAZ and will be distributed to national programs in Africa and Latin America where the Mexican bean weevil is an important storage pest.
Introduccion
Se han detectado niveles de resistencia por antibiosis a los gorgojos del frijol
Arcelina, una proteína nueva, ha sido reportada como el factor responsable de la resistencia a Z.
La caracterización del efecto de arcelina sobre
Mediante retrocruzas se han desarrollado en el CIAT cientos de líneas de fríjol a partir de cuatro de las variantes electroforéticas de arcelina, con niveles variables de resistencia al insecto. El presente trabajo describe el sistema que se ha desarrollado en el CIAT para la obtención de líneas de fríjol resistentes a
Electroforesis unidimensional (SDS-PAGE) de cinco variantes de arcelina. Líneas 1-3: G 02771 arcelina 5; 4: G 12882 arcelina 1; 5: G 12866 arcelina 2; 6: G 12922 arcelina 3; 7: G 12949 arcelina 4; 8: Pijao; M: marcador de peso molecular. La flecha indica la banda de arcelina 5.
Prueba serológica de Ouchterlony que detecta la presencia de arcelina, utilizada en la obtención de líneas de fríjol con resistencia a Z. subfasciatus. Reacción positiva en muestras 1, 4 y 5.
Materiales Y Metodos
Cria masal del insecto y Evaluaciones de Resistencia
Para las evaluaciones de resistencia de materiales silvestres y líneas mejoradas por resistencia a
Se registraron las siguientes variables: días a emergencia de los adultos, porcentaje de emergencia y porcentaje de semillas con daño 55 días después de la infestación. Los datos se sometieron a análisis de varianza, previa transformación de los porcentajes a arco seno x. Cuando la prueba de F fue significativa, los promedios se compararon mediante la prueba de rangos múltiples de Duncan (SAS Institute 1985).
Para comparar entre tratamientos y discriminar los niveles de resistencia de los genotipos y líneas de fríjol evaluadas, se utilizó el siguiente índice de susceptibilidad (Is) (Dobie 1974), cuyos valores no fueron analizados estadísticamente:
Técnicas para detectar la proteina
La presencia de arcelina y la identificación de sus cinco variantes se hizo por medio de electroforesis de una dimensión en geles de poliacrilamida (SDS/PAGE), de acuerdo con el método de Laemmli (1970) modificado por Ma y Bliss (1978), utilizando un equipo Hoeffer Scientific Instrument. Larelación arcelina/faseolina se estimó mediante un densitómetro laser ultroscan XL (LKB-Bromma).
La arcelina también se detectó por medio de la prueba serológica de inmunodifusión (Ouchterlony 1968) según el método descrito por Garvey et al. (1977). Para la prueba serológica se utilizaron 5 µl de cada muestra (15 mg de harina de cada semilla en 200 µl del buffer 0,5M NaCl; pH 3,2, suspendida a temperatura ambiente durante 30 minutos) y 5 µl del anticuerpo de arcelina 1 ó arcelina 4 para detectar arcelina 1,3 y 4 ó el anticuerpo de arcelina 1 para detectar arcelina 2. Los anticuerpos se obtuvieron en la Universidad de Wisconsin y en la Unidad de Virología del CIAT a partir de la inoculación en conejos blancos New Zealand de arcelinas 1 y 4 puras, para lo cual se hizo una serie de cuatro inyecciones intramusculares a intervalos semanales, inoculando en cada inyección 0,5 ml del antígeno emulsificado en un volumen igual, completo ó incompleto de adyuvante de Freund.
Metodo de mejoramiento
Debido a que arcelina se hereda como un gen simple dominante (Romero Andreas et al. 1986), se desarrolló el esquema de mejoramiento por el sistema de retrocruzas descrito en la Fig. 3, con el fin de transferir la resistencia de fríjoles silvestres a cultivares comerciales. Como padres donantes de resistencia se emplearon los genotipos silvestres G 12882, G 12866, G 12922 y G 12952, seleccionados y purificados por electroforesis por la presencia de arcelina 1,2,3 ó 4, respectivamente. También se utilizaron dos líneas retrocruzadas a fríjol Pinto y una línea retrocruzada a la variedad Sanilac obtenidas por Harmsen et al. (1989).
Como padres cultivados se utilizaron fríjoles comerciales susceptibles a
El proceso mostrado en la Figura 3 consistió en seleccionar por la presencia de arcelina, semillas F1 de primeras retrocruzas y semillas F1 y F2 de segundas retrocruzas mediante la prueba serológica de Ouchterlony, seleccionando para la siembra en cada generación las semillas positivas y descartando las negativas. En la F2 de segundas retrocruzas se sembraron solamente las semillas positivas homocigotas dominantes para la presencia de arcelina; tanto en F1 como en F2 de segundas retrocruzas se hicieron selecciones agronómicas en campo. Las progenies F3 así obtenidas se sometieron al insecto en pruebas replicadas, seleccionando para la siembra las progenies resistentes. Las líneas F4 también fueron probadas con el insecto en pruebas replicadas y aquellas que resultaron resistentes se codificaron como líneas RAZ.
La ventaja de este sistema de retrocruzas radicó en que al cabo de dos ó tres generaciones se pudo incorporar el gen de la proteína, conservando las características deseables comerciales del genotipo susceptible utilizado como padre recurrente.
Esquema de mejoramiento para la obtención de líneas de fríjol con resistencia a Z. subfasciatus.
Materiales vegetales
Cinco genotipos silvestres: G 12882, G 12866, G 12922, G 12952 y G 02771, de reacción conocida al insecto (Cardona et al. 1989), se seleccionaron mediante electroforesis por la presencia de las variantes 1,2,3,4 y 5 de arcelina, respectivamente (Fig. 1); las semillas positivas para la presencia de cada variante se multiplicaron bajo condiciones de invernadero (T=28°C; R.H.=75-85%) y se cosecharon en forma masal. Posteriormente se evaluaron por resistencia al insecto y se compararon con el testigo comercial, Calima, en una serie de cuatro experimentos de cinco repeticiones por experimento, según la metodología de evaluación descrita anteriormente.
También se probaron por resistencia al insecto las generaciones F3 y F4 de 118 líneas mejoradas obtenidas con las diferentes variantes de arcelina por el sistema de mejoramiento descrito. En cada ocasión, las líneas se probaron en tres ó cuatro repeticiones de 50 semillas infestadas con siete parejas por repetición. Se emplearon como testigos el genotipo silvestre G 12952 (resistente) y la variedad Pijao (susceptible). Se hizo el análisis combinado de varianza con cada una de las variantes de arcelina.
Las diez mejores líneas RAZ, derivadas de cruces con arcelina 1, se evaluaron en tres y cuatro repeticiones durante cuatro generaciones consecutivas para registrar, además del porcentaje de emergencia de
Determinación de calidad culinaria
Para evaluar la calidad culinaria de las 10 líneas RAZ mencionadas y el correspondiente testigo comercial, se determinó el tiempo de cocción medio en un cocinador Mattson modificado. Este método requirió 25 semillas de cada línea RAZ y el tiempo medio de cocción se determinó como aquel en el que las agujas del cocinador penetraron el 50% de los granos probados.
Resultados Y Discusion
Evaluación de cinco variantes Electroforeticas de Arcelina en Genotipos Silvestres de P. vulgaris
En la evaluación de cinco genotipos silvestres purificados por la presencia de cada variante electroforética de arcelina (Fig. 1) se obtuvo que estos genotipos fueron resistentes en comparación con el testigo susceptible Calima, pero con efectos diferentes de cada variante en la biología de
Efecto de cinco variantes electroforéticas de arcelina sobre la biología de
Promedio de cuatro evaluaciones y cinco repeticiones por evaluación. En cada columna, los promedios seguidos por la misma letra no difieren significativamente al nivel del 1% (Duncan)
2)
Evaluación de Lineas de Frijol derivadas de cuatro variantes Electroforeticas de Arcelina
El análisis combinado de varianza para las líneas con arcelina 1,2,3,4 mostró diferencias significativas entre las fuentes de resistencia (Tabla 2), ya que las líneas avanzadas derivadas de arcelina 1 resultaron altamente resistentes a
Resistencia a
Promedio de cuatro evaluaciones y cinco repeticiones por evaluación. En cada columna, los promedios seguidos por la misma letra no difieren significativamente al nivel del 1% (Duncan)
Las líneas con arcelina 3 (Tabla 2) fueron susceptibles a
Para tratar de explicar las razones por las cuales se pierden los niveles de resistencia presentes en la arcelina 4 (Tabla 1) y debido a que existe respuesta significativa a la dosis de arcelina (Osborn et al. 1988; Cardona et al. 1989), se estudió la posibilidad de que concentraciones bajas de la proteína en estas líneas fueran la causa de los bajos niveles de resistencia al insecto. Para ello, se gráfico la relación arcelina/faseolina de cada línea con arcelina 4 y del respectivo padre silvestre, contra los valores del índice de susceptibilidad. Se encontró que todas las líneas con arcelina 4 mostraron bajas concentraciones de la proteína y altos niveles de susceptibilidad a diferencia del padre, el cual mostró valores altos de arcelina y baja susceptibilidad al insecto. Actualmente, se está estudiando la estructura molecular de las variantes de arcelina para tratar de explicar por qué la concentración de la proteína disminuye en las progenies con arcelina 4, expresándose en niveles de susceptibilidad. Tal como lo demostraron Osborn et al (1986), las variantes 1,2 y 3 no presentan polipéptidos comunes, mientras que las variantes 3 y 4 parecen tener similitud estructural, lo cual podría ser una explicación para la inefectividad de los padres que contienen arcelina 4.
Según el análisis combinado (Tabla 2), los más altos niveles de resistencia a
Evaluación intensiva de Lineas de Fríjol con Arcelina 1
Debido a que los más altos niveles de resistencia a
Niveles de susceptibilidad y de daño en líneas de fríjol mejoradas por resistencia a
DDI=Días después de infestación.
En cada columna, los promedios seguidos por la misma letra no difieren significativamente al nivel del 1% (Duncan).
Aparte de los aspectos entomológicos favorables, estas líneas presentaron buenas caracteristicas agronómicas (Tabla 4), expresados en tamaños y colores de granos comerciales con características deseables para diferentes tipos de consumidores. Cuando se sembraron durante tres semestres consecutivos presentaron hábitos de crecimiento arbustivo y días a floración comparables con los del testigo comercial, Pijao; produjeron también altos rendimientos, en la mayoría de los casos superiores al testigo en mención. Además, tuvieron caracteristicas favorables de aceptibilidad, pues registraron bajos tiempos de cocción con un rango de 16 minutos en RAZ 2, que representa un fríjol blando, a 23 minutos en RAZ 5 y RAZ 10, valores normales para el fríjol, e inferiores a los del testigo comercial (Tabla 4).
Características agronómicas y de calidad culinaria de líneas de fríjol mejoradas por resistencia a
Como la obtención de estas líneas con resistencia al gorgojo del fríjol se ha logrado por la transferencia de arcelina a fríjoles cultivados y debido a que ésta es una proteína nueva, se consideró indispensable hacer evaluaciones biológicas para establecer posibles efectos tóxicos en mamíferos. Los resultados obtenidos en la Universidad de Michigan, el Instituto de Nutrición de Centro America y Panamá (INCAP), la Universidad de Durham y el CIAT indican que no existen problemas toxicológicos, ya que se trata de una proteína lábil que se degrada cuando el fríjol es cocinado.
Los resultados descritos indican que es posible obtener en fríjol almacenado, altos niveles de protección contra