Estudios de Patogenicidad de Un Hongo Asociado Con Tetranychus Urticae Koch Acaro Plaga de la Yuca

Abstract

The twospotted spider mite, Tetranychus urticae Koch, is a pest that causes considerable loses in the cassava crop (Manihot escuelenta Crantz). However, there have been detected epizootics that affect its populations. To determine the epidemic causes, laboratory studies were carried out attempting to infect healthy mites. Also, daily observations were done with the disecting microscope registering the disease symptoms. Finally, mites were mounted on slides to be examinated using phase contrast microscopy in order to confirm presence of the fungal pathogen and its identification. The results indicated that a reinfection could occur when a healthy mite and an infected one were put together under 100% R.H. and a temperature of 26°C. The symptoms consisted of changes in their natural body color, sluggish movements, death, mummification and sometimes invasion by secondary pathogens; in addition, during this process, infected mites increased their volume (swollen bodies). Each one of these symptoms was related with a developmental stage of a fungus, which was identified as beloging to the genus Entomophthora.

Introduccion

La yuca (Manihot esculenta Crantz), de gran importancia para el hombre, es una planta que sufre el ataque de va-rias plagas, y entre ellas se destacan los ácaros, particularmente de la familia Tetranychidae (Acari), que ocasionan pérdidas hasta del 53% (Bellotti y Guerrero 1977). Los ataques se han registrado durante las épocas secas, cuando se incrementan las poblaciones del ácaro Tetranychus urticae Koch, una especie cosmopolita que ataca un gran número de plantas.

El manejo de las poblaciones de Tetranychus spp. se basa en el empleo de acaricidas; sin embargo, el frecuente uso de plaguicidas ha disminuido las poblaciones de los enemigos naturales, agravando así el problema causado por los ácaros fitófagos (De Moraes 1986). Además, hay factores intrínsecos en los ácaros como son: “ciclo biológico cor-to, potencial reproductivo alto, siste-ma genético haplo-diploide que incide en una rápida eliminación de los ma-chos susceptibles, tasa de mutación alta y distribución de campo en colonias que reduce el flujo genético entre ellas y dificulta la dilución de los genes re-sistentes”, los cuales han sido sugeri-dos por varios autores como respon-sables de que los ácaros adquieran re-sistencia a los plaguicidas en un tiempo relativamente corto (DeMoraes 1986).

Debido al rápido desarrollo de resis-tencia de los ácaros a los productos químicos, así como los altos costos de los plaguicidas, los hongos ento-mopatógenos se constituyen en un importante medio de control que pue-de ser empleado para manejar pobla-ciones de plagas biológicamente (Ca-brera et al. 1987; De Moraes 1986).

En los últimos años se ha incremen-tado el número de registros relaciona-dos con enfermedades infecciosas de los ácaros. El interés creciente se debe a que su aplicación no es puramente de naturaleza académica, sino también aplicada. Actuando como patógenos de ácaros se conocen únicamente virus y hongos, pero posiblemente estudios posteriores podrán revelar nombres de grupos nuevos de micro-organismos que también sean patóge-nos (Van der Geest 1985). El control biológico natural de hongos sobre po-blaciones de ácaros causa mortalidades superiores a un 80% (Weiser y Muma 1966; Saba 1971; Tsintsadze et al. 1976; Carner 1976; Gardner et al. 1982; Smitley et al. 1986; Cabrera et al. 1987), lo cual muestra un potencial por explotar en el combate de los áca-ros plaga.

Para el inicio del estudio de una enfer-medad es muy importante tener en cuenta la mortalidad irregular de áca-ros de una población, ya que puede ser el resultado de una infección esporádi-ca o el principio de una epizootia. Las epizootias se catacterizan por la pre-sencia de una enfermedad infecciosa y una alta mortalidad del huésped; oca-sionalmente el patógeno no es visible bajo el microscopio de luz (Weiser y Briggs 1977).

Para investigadores como Tsintsadze et al. (1976), implementar un control de ácaros de la familia Tetranychidae con un hongo como Entomophthora no es complejo; para la introducción del agente causal dentro de un invernadero se requiere de una serie de labores si-milar a la que utiliza un método bioló-gico común, como es el de utilizar áca-ros de la familia Phytoseiidae.

En el Centro Internacional de Agricul-tura Tropical, CIAT, en Palmira, Co-lombia, se han observado mortalidades irregulares de ácaros de las especies T. urticae y Mononychellus progressivus Doreste, los cuales presentan momifi-cación y cierta esporulación. La momi-ficación se ha atribuido a un hongo, posible entomopatógeno que probable-mente sea el mismo que provoca su muerte.

Con base en lo expuesto anteriormen-te, el presente trabajo se realizó a par-tir del primer semestre de 1989 y los objetivos fueron:

1. Demostrar la relación existente entre la presencia de ácaros enfer-mos de la especie T. urticae en condiciones de campo y los hongos asociados.

2. Identificar el hongo asociado con los ácaros enfermos.

3. Diseñar un método de pruebas de patogenicidad bajo condiciones favorables para la expresión de síntomas.

Revision de Literatura

La literatura internacional que reporta la acción de hongos como patógenos de ácaros es abundante; sin embargo, es poco lo que se ha trabajado con es-tos hongos bajo condiciones de labora-torio y mucho menos en el campo.

De acuerdo con Wiser y Briggs (1977), Petch, en 1940, fue el primero en re-portar una infección causada por Ento-mophthora sp. sobre el ácaro Halotydeus destructor. Una de las primeras observaciones de un hongo infectando ácaros de la familia Tetranychidae fue hecha por Fisher en 1951 en la Florida. Una especie de Entomophthora, probablemente Neozygites, causan-do mortalidades entre 32-95% en una población del ácaro rojo de los cítri-cos, Panonychus citri (Mc Gregor), con alta humedad se produjo un nú-mero alto de conifióforos sobre la su-perficie del cuerpo.

Weiser (1968) describió a Neozygites (Triplosporium = Entomophthora) establecido sobre T. urticae. El hongo causaba alta mortalidad (80-85%) so-bre poblaciones naturales del ácaro en un huerto de frutales en Checoeslova-quia. Este hongo produjo en forma general conidias piriformes de 15-17 x 12-15 micras.

Entomophthora fue probablemente uno de los mejores agentes para el control natural de poblaciones de T. urticae, sobre algodón en Alaba-ma (E.E.U.U.), alcanzando un máximo de infección del 100% en algunas par-celas experimentales (Carner y Caner-day 1970).

Neozygites floridana (Weiser y Muma) se reportó sobre el ácaro texano de los cítricos, Eutetranychus banksi (Mc Gregor), causando una mortalidad por encima del 86%; el hongo produjo co-nidióforos individuales con conidias piriformes (Welser y Muma 1966).

Triplosporium floridanum (Weiser y Muma) se encontró actuando sobre T. urticae en Israel (Kenneth et al. 1972) y E. floridana actuando sobre Oligonychus ondoensis en Japón (Van der Geest 1985).

Un Entomophthora sp. cercano a floridana fue reportado en los Estados Unidos ocasionando la muerte de T. urticae en 3,38 días a 25°C sobre hojas frescas de haba en cajas de petri; el hongo desarrolló unos cuerpos hifa-les en forma de varilla dentro del he-mocelo del ácaro (Carner 1976).

En un trabajo realizado bajo inverna-dero en la Unión Soviética se produjo infección sobre una población de T. urticae, y todos los ácaros murieron por “Entomophthorosis” durante los siguientes 15 días después de introdu-cido el hongo y la plaga no volvió a aparecer en el invernadero durante los siguientes 5,5 meses (Tsintsadze et al. 1976).

El hongo Triplosporium sp. fue repor-tado sobre T. evansi en tomate en Bra-sil, afectando todos los estados de áca-ro (Humber et al. 1981). Un Neozygi-tes cercano a adjarica fue establecido por Keller y Wuest (1983), sobre T. urticae en plantas de fríjol.

Las fluctuaciones de las poblaciones de ácaros no son atribuidas exclusivamen-te a los factores físicos del ambiente (Carner y Canerday 1970), al punto que Smitley et al. (1986a) aseguran que las condiciones del tiempo no pa-recen tener una causa directa en los descensos de las poblaciones de ácaros, ya que éstas siguen creciendo rápida-mente durante todas las condiciones de tiempo, incluso en períodos de fuerte lluvia y alta humedad relativa. En este estudio, que duró tres años, se demostró que los descensos de la po-blación de T. urticae estaban asociados con epizootias de N. floridana cuando las condiciones del tiempo eran húme-das y con las dispersiones aéreas de los ácaros cuando las condiciones del tiempo eran secas, durante el estudio le produjeron a las poblaciones de de-predadores.

Después de reseñar las ideas expuestas por varios autores se puede sugerir que es muy importante considerar la inte-racción de la actividad patogénica de los hongos sobre los ácaros y el efecto de las condiciones ambientales que favorecen el desarrollo del hongo y la enferme-dad. Son escasos los trabajos con hongos de acción patogénica sobre ácaros en el laboratorio; por esta razón es muy im-portante someter al hongo-patógeno en condiciones de humedad relativa y la temperatura, si se quiere obtener resultados satisfactorios en la reinfec-ción de un huésped, al experimentar con conidias de los hongos entomopató-genos (Rombach y Gillespie 1988).

Aparentemente la acción patogénica del hongo Triplosporium floridanum con el efecto regulador de la lluvia son factores importantes en la reducción de la población del ácaro T. evansi (Humber et al. 1981).

En Cuba las poblaciones del ácaro Brevipalpus phoenicis sp. y del hongo Hirsutella thompsonii (Fisher) están presen-tes durante todo el año sobre las hojas del guayabo, aunque ambos experi-mentan períodos de fluctuaciones es-tacionales (Cabrera et al. 1987).

En un período de alta incidencia de mortalidad de T. urticae causada por E. fresenii sobre las hojas de algodón, se demostró que todas las hojas húme-das que se rociaron sobre las hojas mos-traron síntomas de infección. La tempe-ratura máxima fue de 80°F y la míni-ma de 71°F (Carner y Canerday 1968).

En algunos casos ocurre que siendo fa-vorables las condiciones ambientales para el incremento de las poblaciones de ácaros, éstos poblaciones desapa-recen en niveles muy bajos debido a la acción patogénica del hongo Entomophthora fresenii. Según reportan Carner y Canerday (1970), en campos de algodón de Anburn, en E.E.U.U., la humedad relativa en niveles relativos junto con altas temperaturas favorecen la infección por hongos y la germina-ción de las esporas (Kenneth et al. 1972; Saba 1974; Carner 1976; Brandemburg y Kennedy, 1982). Todos los ante-riores estudios y registros muestran que los hongos entomopatógenos juegan un papel importante en la regulación natural de las poblacio-nes de los ácaros.

La multiplicación de los hongos por métodos de fermento, en medios lí-quidos o sólidos, ha permitido lograr el crecimiento del hongo E. fresenii, un patógeno de T. urticae, en me-dio de caldos usando granos des-fortunados (Carner y Canerday 1968). [A] M. Wasicek, trabajando en el laboratorio de investigaciones experimentales de la Universidad de Amsterdam, aisló un hongo del géne-ro Fusarium de un lote de ácaros que fue el cual fue descrito como Cephalosporium subversiciliatum y años después, se encontró que esta misma forma de Verticillium lecanii (Zimm) Viegas (Van der Geest 1985).

Kenneth et al. (1979) registraron a H. thompsonii, un hongo patógeno de muchos ácaros que creció y esporuló sobre afrecho de trigo esterilizado. Este hongo es termotolerante, ya que conidia y esporula a 25 y 30°C. Este hongo esporula igual-mente en la oscuridad y en presencia de luz. El rango de temperatura ideal para su crecimiento es de 25-30°C. Este hongo esporuló a 25-30°C a una humedad relativa de 90-100%.

Sin embargo, investigadores como Tsintsadze et al. (1976) aseguran que es fácil mantener un hongo den-tro del invernadero sobre una in-fección de T. urticae vivo bajo condi-ciones de laboratorio, lo cual daría una fuente de inóculo para la dispersión y reinfección de otros áca-ros, la característica de los hongos Entomophthoraceae de tener la ha-bilidad de descargar activamente conidias, mejoran su potencial para poderse dispersar y causar epizootias (Gillespie 1988).

En cuanto a la identificación de los hongos patógenos de ácaros, las cla-ves taxonómicas no han sido elabora-das de forma detallada; los caracteres de muchas especies se han descrito con un método clásico, lo que a veces ha causado confusiones. Sin embargo, en el caso de los hongos del orden Entomopthorales, se han dado pasos para el esclarecimiento taxonómico de algu-nas familias y géneros, usando como una herramienta útil para la identifi-cación el tipo y tamaño de conidias. Aún no se ha desarrollado una cla-sificación taxonómica que sea aceptada por todos los investigadores; sin em-bargo, en los últimos años se ha dado un importante paso con el trabajo de Humber, que ha desarrollado nuevas claves taxonómicas basadas en una re-visión detallada de caracteres, lo que ha permitido una identificación más precisa. El sistema de Humber es un paso importante hacia una mayor claridad taxonómica de los hongos entomopatógenos. Se han desa-rrollado claves taxonómicas para la clasificación de varios géneros de la familia Entomophtoraceae, tales como Entomophthora, Entomophaga, Erynia, Conidiobolus, Basidiobolus, Neozygites y Zoophtora. Estos avances en la taxonomía han facilitado enormemente la identificación de especies. Se ha trabajado mucho en este tema en los últimos años, pero todavía hay mucho debate en los círculos académicos, aunque algunas clasificaciones ya están alcanzando un consenso más amplio. La clasificación de Remaudière y Keller (1981) ahora es aceptada solo para el complejo de géneros de Entomophaga que incluye los géneros Entomophaga, Erynia, Conidiobolus, Entomophthora, Erynia, Massospora, Neozygites y Zoophthora. La última revisión taxonómica, que ha sido modificada, la propuesta la hizo, que es aceptada, incluye los géneros Entomophaga, Entomophthora, Erynia, Conidiobolus, Basidiobolus y Tarichium (Humber et al. 1981; Gillespie 1988).

Hasta la fecha hace falta mucho trabajo sistemático como guía para la determinaciónde hongos patógenos de ácaros y también son casi inexistentes los esquemas y ayudas visuales que ilustren su morfología, estructura y la sintomatología correspondiente a la infección que causan.

Materiales Y Metodos

El trabajo fue realizado en las instalaciones del Centro Internacional de Agricultura Tropical, CIAT, en Palmira (Valle), donde se presumía encontrar individuos de T. urticae infectados. En varios lotes del CIAT se recolectaron hojas de yuca de diferentes clones y se llevaron, en condiciones de total asepsia y en el menor tiempo posible, hasta el laboratorio, para ser examinadas bajo el microscopio estereoscópico. En los sitos de recolección siempre se registró la temperatura y la humedad relativa. Se seleccionaron todos los ácaros muertos que presentaban cambios en color, forma y apariencia. La muestra se dividió en tres grupos: el primero se destinó para comprobar la presencia del patógeno; el segundo, para la identificación tanto del patógeno como del ácaro y el tercero, para las pruebas de patogenicidad o reinfección, efectuando los estudios de sin. tomatología.

Los ácaros de los dos primeros gru-pos se aclararon con solución de lactofenol, se lavaron con agua destilada y se montaron en medio Hoyer's, para ser examinados en un microscopio de contraste de fase.

El tercer grupo de ácaros se subdividió en dos. Una parte se empleó para observar los detalles que ocu-rrían en los ácaros moribundos; para esto se colocaron individual-mente sobre trozos de hoja de yuca esterilizada. La otra par-te se empleó para reinfestar ácaros sanos, lo cual se manejó de varias maneras. Se seleccionaron ácaros enfermos de una colonia de T. urticae y se colocaron en una caja de petri con una hoja de yuca fresca. Para mantener la humedad relativa alta, se colocaron discos de algodón humedecidos con solución de hipoclorito de sodio al 0.05% y se colocó la caja sobre una malla en un frasco de vidrio que contenía agua. A esta caja se le agregó una colonia sana de ácaros, conectada a sus plantas de yuca, y se colocó en la caja con la colonia enferma. En una caja de petri con una hoja de yuca, se colocó una colonia de ácaros de T. urticae de la misma edad y sobre otra hoja de yuca, que servían como sustrato alimenticio de los ácaros.

El macerado en seco también se asperjó sobre las hojas del sustrato alimenticio. Siempre se empleó un testigo asperjando con agua pura y sin macerado. De otro lado,se colocaron en contacto directo ácaros sanos con ácaros momificados por 24 horas en cámara de humedad y luego se descubrieron las cajas.

Para las pruebas descritas se emplearon cajas de petri provistas de espumas saturadas con agua,soportando discos de hojas de yuca de dos centímetros de diámetro, también frascos de confinamiento de dos centímetros de diámetro, los cuales son empleados para estudios de biología. Tan pronto se logró determinar la sintomatología de la enfermedad, para estudiar la biología del hongo patógeno se montaron ácaros infectados cada seis horas.

Como existe cierta confusión en cuanto a nombres de estructuras y características correspondientes de patógenos, se elaboró y empleó un conjunto de ayudas visuales para facilitar su conocimiento.

Resultados

Durante las recolecciones de ácaros se encontraron los individuos momificados de T. urticae en epizootias bastante representativas, en un invernadero (casa malla) sobre yuca CMC 40 y especialmente sobre fríjol revoltura (4 variedades). El hallazgo de individuos de T. urticae infectados se asoció con una momificación, con el aumento en volumen y con el color que varió de habano claro hasta el negro intenso y brillante; las patas delanteras de estos ácaros quedan estiradas y las manchas ocelares de color rojo se tornan difusas.

Las condiciones promedio de temperatura y humedad relativa en los sitios de recolección en el campo fueron de 30°C, con un rango de 17-38°C y 51 % de HR, con un rango de 38-80%, mientras que en las casas de malla la temperatura maxima de 34°C, con un promedio de 25°C y la HR fue de 76 % alcanzando un máximo del 100%.

Cuando los ácaros del primero y segundo grupo se montaron, se observaron estructuras típicas de un Entomophthora sp., tales como cuerpos hifales, conidias y capiloconidias o conidias adhesivas. Con los ácaros del tercer grupo, a partir de los T. urticae momificados, se determinó que con temperaturas altas (32°C) y una humedad relativa alta (>70%), los ácaros tomaron una coloración muy blanca, con una apariencia de esporulación, aunque algunos inicialmente se oscurecieron bastante para luego si tomar la apariencia de la esporulación. Cuando se mantuvieron en condiciones de 26°C y HR del 60% (promedio de laboratorio) se demoraron unos siete días para que todos tomaran la apariencia de esporulación. A los diez días se comenzó a observar un aparente crecimiento micelial y a los doce días perdieron la apariencia de esporulación y tomaron una apariencia de cristalización. Después de 18 días todos presentaban un oscurecimiento y una apariencia algodonosa. Al repetir las observaciones en cámara de humedad, todo el proceso anterior se redujo a una duración promedio de tres días, con un rango entre dos y cinco días.

Con los cuatro métodos de inoculación para infección se presentaron resultados muy diversos. Se consiguió infección por todos los medios, pero fue más frecuente con la inoculación directa, con la cual se presentaron mortalidades similares a las de campo, pues algunas veces con los otros métodos se presentaban mortalidades caracterizadas por aumento en volumen, pero apariencia de cristalización. Con el fin de comprobar la infección se montaron en placas de microscopía para ser observados.

El trabajo permitió definir los síntomas de infección. Los ácaros progresivamente van perdiendo movilidad y aumentan en volumen, su color se aclara bastante, hasta el punto de perder las dos manchas típicas de color verde oscuro o negro y tomar una apariencia oleácea o brillante; posteriormente, el ácaro muere y se momifica. En este punto ha ganado mucho volumen, las patas delanteras generalmente quedan estiradas, las manchas ocelares de color rojo se tornan difusas y la momificación típica es seca. Estos conocimientos permitieron reinfectar ácaros sanos y estudiar sus cambios internos, al igual que observar la biología del hongo.

Se determinó que cuando el ácaro comienza a presentar la sintomatología, internamente ha comenzado a ser invadido por unos pequeños cuerpos hifales que inicialmente son redondeados, pero luego se van alargando y retorciendo; luego se dividen por fisión en dos y vuelven a alargarse, tomando formas más regulares y agrupándose y llenando el hemocelo del ácaro; esta invasión interna ocasiona la muerte del ácaro. Cuando externamente comienza a momificarse, internamente los cuerpos hifales ya han invadido todo el cuerpo del ácaro, se han agrupado y se van alargando para alcanzar la superficie del ácaro preparándose para la salida.

Cada cuerpo hifal es ancho en su extremo y es el que llega a la pared del exoesqueleto. Si los ácaros momi-ficados se mantienen en condiciones secas no ocurre ningún otro cambio, pero si por el contrario se aumenta la humedad relativa, ésta actúa como ac-tivadora de una serie de procesos, en los cuales el ácaro toma apariencia de esporulación blanca del hongo. Cada cuerpo hifal se constituye en un co-nidióforo; emergen pequeñas protu-berancias y la punta del cuerpo hifal presiona y rompe el exoesqueleto. Los cuerpos hifales emergen por todas partes menos por las patas, las quelíce-ras y el plato ventral.

Cuando cada conidióforo alcanza su máximo tamaño, entonces se rompe y da lugar a las conidias primarias. En las conidias, mantenidas al 100% de HR, se producen muchos cambios; algu-nas se constituyen en nuevos conidió-foros o cuerpos hifales que dan lugar a conidias secundarias y hasta tercia-rias, las cuales sólo se diferencian en su tamaño, siendo un poco más pequeñas. Otras conidias, en lugar de conidiófo-ros, dan lugar a unos tubos delgados o capilares que crecen verticalmente y en su punta forman un ángulo, sobre el cual crecen unas esporas de forma ovalada que en su extremo distal pre-sentan una estructura en forma de co-no pequeño. El capilar que sostiene estas esporas ovaladas se parte fá-cilmente y las esporas van a adherirse, generalmente, a las patas de los ácaros, lo cual hace presumir que el minúsculo cono tiene un poder adhesivo y quizás que éstas sean las estructuras de pro-pagación de la infección a ácaros sanos.

Otros ácaros toman una coloración totalmente negra y no se momifican como los demás, pero internamente presentan muchos más cambios que los momificados de color café; sus coni-dias presentan más de un capilar, los cuales crecen lateralmente, y sobre ellos se desarrollan conidias adhesivas secundarias, La apariencia de la cutí-cula de estos ácaros negros es muy arrugada, a diferencia de la muy lisa de los momificados de color café, Posteriormente, los ácaros toman una apariencia algodonosa y oscura e in-ternamente muestra crecimiento e in-vasión de patógenos secundarios.

Teniendo en cuenta todas las obser-vaciones y el análisis con las claves taxonómicas se concluye que el hongo patógeno del ácaro T. urticae es Entomophthora sp.

En otros trabajos que se realizan en la actualidad, se siguen haciendo pruebas de patogenicidad sobre otras especies de ácaros que atacan la yuca. Con M. tanajoa se ha conseguido reinfectar in-dividuos, pero hay mayor dificultad que sobre T. urticae. En M. caribbea-nae (McGregor) se presentan algunos síntomas claros de infección, por lo cual se ha comenzado a estudiar mi-croscópicamente.

Se ha observado que el hongo patógeno ataca todos los estados de desarro-llo del ácaro menos los huevos. Actual-mente, en otros trabajos, se continúa evaluando la infección sobre los diferentes estados de desarrollo.

Figura 1.

Apariencia externa de un Adulto de T. urticae infectado por Entomophthora sp. 250 x. (Foto: J.M. Alvarez).

Figura 2.

Nacimientos de una conidia primaria (C.P.) de Entomophthora sp, sobre el ácaro T. urticae.

Conclusiones

En el desarrollo de este trabajo se lo-gró determinar por primera vez, para Suramérica, el género y la biología del hongo Entomophthora sp. como causante de patogenicidad sobre el ácaro Tetranychus urticae Koch. Bajo condiciones controladas de laboratorio, se consiguió provocar la reinfección del ácaro T. urticae, con la completa expresión de los síntomas causados por el hongo entomopatógeno Entomophthora sp.

Al haberse comprobado la agresividad del hongo Entomophthora sp. como causante de patogenicidad sobre todos los estados de desarrollo de T. urticae, menos sus huevos, se continúa estu-diando el comportamiento de dicho patógeno en diferentes medios naturales.