Abstract
During a survey conducted in Colombia, an isolate of
Introduccion
Actualmente se conocen miles de aislamientos de varias especies del género
Desde 1985, cuando McGaugey (1985) reportó resistencia de
Materiales Y Metodos
Area y muestras
El área principal de muestreo cubrió la sección nororiental de Colombia, extendiéndose desde Barrancabermeja (Sant.) hasta Currulao (Ant.) en el norte, y a Quibdó (Chocó) en el occidente. Se tomaron muestras de lodo o tierra, debido a que las esporas de las bacterias de ésta especie se sumergen y acumulan en el lodo, en el fondo de los criaderos de larvas de mosquitos (Davidson et al. 1984; Ignoffo et al., 1981; Mulligan et al. 1980; Silapanuntakul et al. 1983). Las muestras fueron tomadas mensualmente en 16 criaderos de mosquitos y colectadas en bolsas o tubos estériles. Estas muestras se mantuvieron selladas a 4°C hasta cuando se inició el procedimiento de aislamiento. En estos criaderos se evaluaron los siguientes parámetros fisicoquímicos: Alcalinidad, dióxido de carbono, oxígeno disuelto, cloruro, dureza, nitritos, conductividad, pH y temperatura, de acuerdo con los metódos analíticos de Hach (Hach Co., Loveland CO.).
Aislamiento de bacterias formadoras de esporas.
Todos los procedimientos de aislamiento fueron desarrollados bajo estrictas condicionea asépticas. Las muestras de lodo o tierra fueron colocadas en tubos de ensayo con 4,5 ml de solución salina tamponada con fosfatos (PBS) pH 7,2, agitada en un agitador ambiental a 250 rpm, a 30°C por 30 minutos. Después de esto, los tubos fueron sometidos a un choque térmico a 78°C durante 15 minutos en un baño de agua con el propósito de eliminar los organismos no formadores de esporas. De allí se tomaron alícuotas de 75 µl y se sembraron con asa de vidrio en cajas de petri con agar nutritivo más extracto de levadura (ANEL) compuesto de 23 g de agar nutritivo y 3 g de extracto de levadura por litro) e incubando a temperatura ambiente (23 ± 2°C).
Las cajas de petri fueron examinadas después de 48 h y las colonias se seleccionaron de acuerdo con los criterios de forma y tamaño, elevación, apariencia del margen y textura de la superficie; y transferidas por separado a nuevas cajas con ANEL. Los aislamientos fueron coloreados por la técnica de Shaffer y Fulton para observar las esporas (S. Singer, comunicación personal) y clasificadas en tres grupos de acuerdo con Smith et al. (1952).
Ensayos con larvas
Búsqueda
La bacteria de tipo I, grupo al cual pertenece el
Bioensayos
Estos experimentos fueron realizados utilizando polvo liofilizado preparado a partir de un cultivo líquido producido en peptona-glucosa-solución de sales (PGSM) (Brownbridge and Margalit 1986). Después de 48 horas de incubación, los cultivos fueron centrifugados y liofilizados. Se homogenizaron 50 miligramos del liofilizado en 3 ml de PBS de acuerdo con los métodos descritos por McLaughlin et al, (1984), y modificados por M. Brownbrigde (Comunicación personal) y ensayado contra 20 larvas de
Características morfológicas y bioquímicas
Las pruebas morfológicas y bioquímicas se realizaron teniendo como puntos de comparación las cepas de referencia B.t.i serotipo 14 y B.t. subsp.
Resultados
Durante la búsqueda de bacterias patogénicas para larvas de mosquito realizada entre febrero y julio de 1988, se colectaron 64 muestras de suelo en 16 diferentes habitat larvales. De ellas, se aislaron 264 colonias de bacterias formadoras de esporas y 125 fueron clasificadas en el grupo I. Sinembargo, solamente una colonia (CIB-131), obtenida en Quibdó (Chocó) mostró toxicidad hacia las larvas de mosquito. Las observaciones microscópicas mostraron un bacilo largo con espora y cristales paraesporales. Las medidas de la célula bacteriana fueron: longuitud 4,94±0,60 μm, ancho 1,18±0,25μm., posición de la espora y forma subterminal y elipsoide, tamaño de la espora 1,71 × 0,87 μm, forma del cristal redondeado con diámetro de 0,79 μm (Tabla 1).
Características morfológicas de dos aislados de
Medidas en micras
T =Terminal; ST = Subterminal; E = Elipsoide; Ro = redondo; Rb = Romboide
Algunas de las características bioquímicas más sobresalientes del B.t.i., y del B.t.m. fueron similares a la cepa CIB-131. El estudio fenotípico realizado a la cepa CIB-131 dió los siguientes resultados: gelatina +, catalasa -, lecitinasa +, oxidasa, crecimiento anaeróbico -, arginina decarboxilasa +, lisina decarboxilasa -, ornitina decarboxilasa, utilización de citrato -, deamination de triptofano, hidrólisis de caseina y almidón +, formación de ácido a partir de glucosa, fructuosa, maltosa, melibiosa, y refinosa, no utilización de sucrosa, lactosa, arabinosa, sorbitol, dulcitol, y celobiosa, hemólisis de glóbulos rojos de cordero tipo a. Los resultados de las pruebas bioquímicas se encuentra en las Tablas 2, 3, y 4, en las cuales se compara con otros dos aislados de B. t.
Utilización de azúcares por dos aislados de
Utilización de aminoácidos por dos aislados de
Caracterización enzimática de dos aislados de
La cepa CIB-131 mostró resistencia natural a amplicilina, azlocilina, aztreonam, carbenicilina, cefotaxime, cefuroxime, cefalexina, lincomicina, metronidazol, oxacilina y penicilina (Tabla 5).
Efecto de algunos agentes antimicrobianos sobre el crecimiento de dos serotipos de
R = Resistente
I = Intermedio
MS = Moderadamente Susceptible
S = Susceptible
La fracción sobrenadante de un cultivo líquido donde se cultivó la cepa CIB-131, no mostró toxicidad hacia las larvas de
Actividad larvicida de
LC50 calculado a partir de polvos liofilizados producidos a partir de cultivos de 48 horas.
Discusion
El hecho de que las bacterias formadodoras de esporas sean resistentes a la sequía y a otros factores ambientales les permite una alta sobrevivencia bajo condiciones adversas y permiten su amplia distribución, explicando así su aislamiento de una gran diversidad de habitats (Sneath 1986). Esta aseveración es respaldada por los recientes aislamientos de Padua et al. (1984) y Brownbrigde y Margalit (1986).
La falta de toxicidad de la fracción sobrenadante del aislamiento CIB-131 es posible que ser explicada por el hecho de que el componente tóxico puede estar asociado con los cristales paraesporales, como fue descrito por Brownbridge y Margalit (1986) para otros aislamiento de
La resistencia natural a agentes antimicrobianos ha sido observada en cepas de
Las medidas de las células, esporas y cristales de las dos cepas de referencia utilizadas (
Footnotes
Agradecimientos
Este trabajo ha sido financiado por la Organización Mundial de la Salud (ID 870321) y Colciencias (2213-05-004-87). Los autores quieren expresar su agradecimiento al personal de Bacteriología y Micología de la Corpotación para Investigaciones Biológicas (CIB), Medellín, y al Servicio Nacional para la Erradicación de la Malaria de Colombia.