Abstract
Arcelin, a new protein, present only in wild beans resistant to
Thus, dominant homocygous lines were highly resistant to the insect, while homocygous recessive lines were highly susceptible. Heterocygous lines were intermediate. The antibiotic effect of arcelin was demonstrated in artificial bean seeds containing increasing levels of the purified protein; the medium lethal concentration (LC50) was 6.5%. The presence of arcelin can be used as a marker for resistance to the insect. A serological technique has been implemented to detect the protein in segregating populations of beans. Positive seeds are multiplied and evaluated for reaction to the insect in F3 and following generations. This method is being utilized to obtain commercial beans resistant to
Introduccion
El gorgojo pintado del fríjol,
Simultáneamente, con los trabajos sobre caracterización de la antibiosis en la Universidad de Wisconsin, en el CIAT, se realizaron estudios bioquímicos sobre las proteínas de los fríjoles silvestres que confirmaron la presencia de una nueva proteína (Osborn et al. 1986), la cual se postuló como posible factor de resistencia a brúchidos, por encontrarse únicamente en fríjoles silvestres resistentes.
El presente trabajo tuvo como finalidad evaluar el efecto antibiótico de esta nueva proteína sobre la biología de
Revision De Literatura
En variedades silvestres de
Las investigaciones que se han efectuado sobre la resistencia a brúchidos en estas variedades silvestres revelaron que se debe al mecanismo de antibiosis (Schoonhoven et al., 1983), es decir, a un efecto deletéreo muy significativo sobre la biología del insecto y su supervivencia. En estudios posteriores, Cardona et al. (1989) encontraron que, como resultado de este efecto, la emergencia de adultos se reduce significativamente, el ciclo de vida de los insectos que logran sobrevivir se prolonga sustancialmente y la progenie resultante se caracteriza por tamaño y peso reducidos. La fecundidad de hembras emergidas de variedades resistentes, también, se reduce significativamente. Cuando se crían colonias del insecto en generaciones sucesivas y en materiales altamente resistentes, éstas no pueden desarrollarse. También, se encontró que el estado de desarrollo de
Osborn et al. (1986) identificaron, por electroforesis, una proteína nueva que Ilamaron arcelina, en honor a la población de Arcelia en el Estado de Guerrero en México, de donde son originarias algunas de las variedades silvestres, previamente reportadas por Schoonhoven et al. (1983) como resistentes a brúchidos.
Esta proteína, que no se encuentra en fríjoles cultivados, se purificó y caracterizó bioquímicamente. También, se comparo con faseolina (principal proteína de la semilla de fríjol común) y con fitohemaglutinina (principal lectina de la semilla de fríjol) (Osborn et al., 1988). Arcelina y lectina tienen características comunes que son: glicoproteínas y están relacionadas antigénicamente. Arcelina, también, tiene alguna actividad hemoaglutinante, característica que está asociada a las lectinas, pero presenta, a su vez, propiedades que la diferencian de éstas, como son un punto isoeléctrico más básico, mayor número de residuos de aminoácidos básicos, residuos adicionales de cisteína y un residuo de metionina que no está presente en la fitohemaglutinina (Osborn et al., 1988).
Esta proteína presenta cuatro variantes electroforéticas con pesos moleculares de 35.000 a 42.000, los cuales consisten en grupos distintos de polipeptidos con movilidad similar en geles bidimensionales. Estas variantes fueron designadas por Osborn et al (1988) como arcelina 1, 2, 3 y 4 y su presencia fue confirmada en CIAT por medio de electroforesis (Figura 1).
Patrón electrónico de cuatro variantes de la proteína arcelina presentes en algunas de las variedades silvestres resistentes a Z. sub fasciatus (codificadas G). Calima e ICA-Pijao son variedades comerciales.
En estudios genéticos sobre la herencia de la proteína, se encontró que la expresión de arcelina está controlada por un gen mendeliano simple y que su presencia es dominante a su ausencia (Romero-Andreas et al., 1986). Aunque, por simple observación, se encontró una correlación entre la presencia de arcelina y la resistencia a Z: subfasciatus, podrían existir otros factores asociados con la resistencia a este insecto. Por esta razón, las investigaciones se encaminaron a caracterizar la proteína como el factor responsable de la resistencia al brúchido (CIAT, 1987).
Materiales Y Metodos
Para evaluar los niveles de resistencia en variedades silvestres y el efecto antibiótico de una proteína nueva sobre la biología de
Evaluacion De Variedades Silvestres Con Y Sin Arcelina
Con el fin de acumular evidencia sobre el efecto de la arcelina en la biología de
Una vez comprobada la presencia o ausencia de arcelina en las variedades en frascos plásticos provistos de tapa con areación, se infectaron plantas correspondientes a cinco repeticiones con siete parejas de
Los datos de porcentaje de emergencia, el tiempo de emergencia de adultos y el peso seco de los adultos se sometieron a análisis de varianza. En algunos casos, se hicieron transformaciones a log (X + 1) y arco seno. Cuando la prueba de F fue significativa, las medias se compararon por medio de la prueba de rangos múltiples de Duncan. Se calculó, también, el siguiente índice de susceptibilidad (Is), el cual se utilizó para la comparación entre tratamientos y para la clasificación de las variedades como resistentes, intermedias o susceptibles.
Evaluacion De Lineas Con El Gen De Arcelina
Con base en el conocimiento de que la herencia de arcelina está controlada por un gen mendeliano simple de carácter dominante, se inició un programa de retrocruzas para introducir el gen de la proteína en variedades cultivadas y evaluar las progenies resultantes, con el fin de determinar la expresión de la herencia en términos de presencia de la proteína y los efectos correspondientes en la biología del insecto.
Se hicieron cruzas entre un padre susceptible cultivado (Sanilac) y un padre silvestre resistente (G. 12882). Las semillas F1 fueron sometidas a análisis electroforético para confirmar la presencia de la proteína en el proceso de hibridación. Posteriormente, se obtuvieron dos generaciones de retrocruzamiento al padre Sanilac, seguidas por dos generaciones de autofecundación. La semilla F2 de las segundas retrocruzadas se evaluó por resistencia al insecto así: dos líneas homocigotas dominantes Arc + / Arc +, cuatro líneas heterocigotas Arc+/arc- y tres líneas homocigotas recesivas arc-/arc-. Se infestaron una o dos repeticiones de 50 semillas, según la disponibilidad de éstas, con siete parejas de
En otro estudio, se evaluaron seis líneas provenientes de segundas retrocruzas, entre dos variedades cultivadas (Pinto) y la variedad silvestre resistente G 12882. Tres de las líneas fueron purificadas por la presencia de arcelina y las otras tres por la ausencia de la proteína. Se infestaron cinco repeticiones de 50 semillas con 7 parejas de Z. subfasciatus por repetición. Como en los casos anteriores, se evaluaron y sometieron a análisis de varianza los siguientes parámetros: porcentaje de emergencia, tiempo de emergencia de adultos, peso de la progenie e índice de susceptibilidad.
Evaluacion De Arcelina Pura En Semilla Artificial
Para poder manipular los niveles de arcelina y evaluar su efecto en la biología del insecto, se adaptó a
Para preparar semillas artificiales, las naturales se remojan por 24 horas y la testa se remueve y el endospermo se deja secar a temperatura ambiente. Una vez seco, se muele para obtener harina de una finura tal que permita su paso por una criba de 0,25 mm. La harina se mezcla con agua destilada y se reconstituye en moldes de teflón. Las semillas moldeadas se congelan por 15 minutos en hielo seco y, posteriormente, en nitrógeno líquido y, luego, se someten a un período de liofilización por 24 horas, después de la cual, se hidratan a temperatura ambiente hasta alcanzar una humedad de 12 a 14%. Una vez hidratadas, se cubren con gelatina pura a una concentración del 10%, quedando listas para ser infestadas. Con este método de semilla artificial se uniformizan características, tales como color, tamaño y forma de las semillas y se pueden añadir, a voluntad, concentraciones de sustancias que se quieran evaluar.
Con esta técnica, se hicieron tres estudios. El primero consistió en comparar el desarrollo de
En el segundo estudio, se midió el efecto de genotipos resistentes en la biología de
Para cada concentración y genotipo se evaluaron cuatro repeticiones de cinco semillas infestadas con 5 huevos de
En el tercer estudio, se midió el efecto de tres concentraciones de arcelina pura sobre la biología de
Evaluacion De Lineas Mejoradas Seleccionadas Por La Presencia De Arcelina
Mediante la prueba serológica de Ouchterlony, también, se detecta la proteína "arcelina" (Garvey et al, 1977). Esta técnica, que consiste en una reacción antigeno-anticuerpo (Figura 2), presenta ventajas sobre la electroforesis, por ser una prueba de reacción rápida que permite la selección por la presencia de la proteína de una mayor cantidad de muestras diarias. El anticuerpo se obtiene a partir de la inoculación de la proteína pura en conejos. Las muestras de fríjol, aproximadamente 15 mg de harina de cada semilla, se suspenden en 200 µl del buffer de extracción (NaC1 0,5 M; ph 3.2) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Para la prueba se utilizan 5 µl de cada muestra.
Prueba serológica de Ouchterlony que revela la presencia de arcelina. Reacción positiva en las muestras 1, 4 y 5.
Con el fin de demostrar que la presencia del gen de arcelina imparte resistencia a
Resultados Y Discusion
Evaluacion De Variedades Silvestres Con Y Sin Arcelina
La evaluación de los niveles de resistencia entre variedades silvestres indicó que los materiales positivos para la presencia de arcelina mostraron altos niveles de resistencia a
Niveles de resistencia a
Promedios seguidos por la misma letra en la misma columna, no difieren significativamente el nivel del 5% (Duncan).
Evaluacion De Lineas Con El Gen De Arcelina
De acuerdo con los índices de susceptibilidad, las líneas homocigotas dominantes (Arc +/ Arc +) fueron altamente resistentes en comparación con las homocigotas recesivas (arc-/arc-), que fueron totalmente susceptibles. Las líneas heterocigotas Arc +/arc- mostraron resistencia intermedia (Tabla 2). Este tipo de segregación es la esperada para un gen mendeliano simple, confirmando, así, por la reacción del insecto, los patrones de segregación para el gen arcelina, determinados por Romero-Andreas (1986). Los resultados sugieren, también, que las líneas para seleccionar en un proceso de mejoramiento deben ser homocigotas dominantes para arcelina, debido al alto nivel de resistencia impartido por la proteína.
Resistencia a
Las líneas de fríjol Pinto, homocigotas para la presencia de arcelina (Arc +), resultaron altamente resistentes al insecto, mientras que las negativas (arc-) fueron completamente susceptibles con diferencias estadísticas significativas en todas las variables evaluadas (Tabla 3). Se comprobó, entonces, un efecto deletéreo de la presencia de la proteína en la biología de
Niveles de resistencia a
Evaluacion De Arcelina En Semilla Artificial
Evaluaciones previas en semilla artificial habían indicado que los resultados de resistencia y susceptibilidad eran consistentes y comparables con los resultados en semilla natural. Esto se confirmó cuando se comparó el desarrollo de
Comparación del desarrollo de
Promedios seguidos por la misma letra en la misma columna no difieren significativamente al nivel del 5% (Duncan).
Cuando se prepararon semillas artificiales con niveles crecientes de harina de semilla de las variedades resistentes G 12866 y G 12949, se registró una prolongación significativa en el tiempo de emergencia de adultos a medida que aumentó la concentración. Se registró un efecto mayor del genotipo G12949 que, a concentraciones superiores al 60%, no permitió emergencia de adultos (Figura 3).
Relación entre el porcentaje de variedad resistente en la dieta y días de emergencia de adultos de
Al estudiar el efecto de las concentraciones de arcelina pura en las semillas artificiales de Sanilac, se encontró que en la concentración más baja probada, 2.5%, arcelina no presentó un efecto antibiótico significativo en la biología de
Semillas artificiales preparadas con harina de la variedad susceptible Sanilac a la cual se agregan dosis crecientes de arcelina pura. Al 10% el daño fue mínimo.
Efecto de arcelina pura en los días a emergencia de
Se encontró que la concentración letal media (CL50) fue 6.5% ± 1.5. En un segundo ensayo, la concentración letal media fue 6.8% ± 0.97.
Evaluacion De Lineas Mejoradas Seleccionadas Por La Presencia De Arcelina
En la Tabla 5, se presentan los resultados de la evaluación entomológica de progenies F4 seleccionadas por la presencia de arcelina según la prueba serológica de Ouchterlony. De acuerdo con el índice de susceptibilidad, estas progenies presentaron altos niveles de resistencia. Por estas razones, el proceso de selección, con base en presencia de la proteína arcelina, se siguió implementando con el fin de obtener a corto plazo fríjoles comerciales con resistencia a esta plaga. En la actualidad, el proceso de mejoramiento consiste en seleccionar, por la presencia de arcelina, semillas F1 de primeras retrocruzas y semillas F1 y F2 de segundas retrocruzas. En cada etapa de selección las semillas positivas ARC + se seleccionan para la siembra y las semillas negativas ARC- se descartan. En semillas F2 de segundas retrocruzas se siembran solamente las positivas (homocigotas dominantes) y se realizan selecciones por agronomía en el campo, para evaluar la resistencia de estos materiales al insecto a partir de progenies F3 y generaciones subsiguientes.
Evaluación de la resistencia a
Conclusiones
La Arcelina, una proteína nueva presente únicamente en los fríjoles silvestres resistentes, es el factor responsable de antibiosis a
Los resultados de resistencia y susceptibilidad a
La arcelina se detecta por electroforesis y por medio de la prueba serológica de Ouchterlony. Como ésta última es más sencilla, se está usando en forma rutinaria para seleccionar semillas por la presencia de arcelina, utilizando la proteína como marcador de resistencia a
El gen de arcelina puede transferirse y es mendeliano simple y se está incorporando en fríjoles cultivados mediante un proceso de retrocruzas para obtener fríjoles resistentes a esta plaga de almacenamiento.