The cassava hornworm Erinnyis ello can cause yield reduction up to 64% depending upon plant age, number of attacks and agroecological conditions.
The virus Baculovirus erinnyis is one of 30 natural enemies reported for cassava hornworm. B. erinnyis constitutes a potential control agent since it can reduce pest populations below the econom ic threshold.
Experiments were conducted at CIAT to determine the effect of B. erinnyis when used fresh, refrigerated during 4 years and stored in powder form during 2 years at room temperature. The virus was applied in the field on experimental plots and under laboratory conditions on cassava leaves at 30.0, 6.0 and 0.26º/o concentrations.
lsolation, purification and storage methods were studied to facilitate the virus practica! use by farmers.
Results show that B. erinnyis can be obtained from infested larvae by easy methods and can be applied by conventional methods to obtain significant control at 72 and 161 hours after application.
Introduccion
Erinnyis ello (L), gusano cachón de la yuca, puede causar pérdidas hasta de un 64% en la producción de raíces (Arias, Bellotti, 1984), dependiendo de la edad de las plantas, el número de ataques del insecto y las condiciones agro-ecológicas en que se desarrolla el cultivo.
Existen más de 30 agentes naturales de esta plaga, los cuales permiten mantener un equilibrio durante períodos que pueden variar entre 3 y 7 años. Un agente promisorio de control del gusano cachón es el Baculovirus erinnyis, virus de la granulosis nuclear, el cual puede reducir las poblaciones de esta plaga a niveles inferiores al umbral de daño económico.
Bajo condiciones de campo y de laboratorio, se han realizado en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) varias investigaciones, con el objeto de determinar la efectividad del virus en el control de E. ello, así: 1. Utilizando Baculovirus impuro recién colectado, con menos de 2 meses de almacenamiento en frío (3-4°C); 2. Baculovirus impuro, con 4 años de almacenamiento en frío y 3. Baculovirus puro (liofilizado), almacenado dos años en ambiente seco y fresco.
Revision De Literatura
Los virus que causan enfermedades en insectos juegan un papel muy importante en la regulación de sus poblaciones, tanto en condiciones naturales como cuando se los usa en programas de control (Bustillo, 1984).
Desde el punto de vista de las investigaciones básicas, quizás la de los virus ha sido el área más activa de investigación en la patología de insectos. Actualmente, se conocen cerca de 250 infecciones virosas en aproximadamente 175 insectos y arácnidos. De esta cantidad, 170 son poliedrosis nucleares, 30 poliedrosis citoplasmáticas, 35 granulosis y se conocen 8 que parece no están asociados con inclusiones de ninguna clase (De Bach, 1964). Los Baculovirus comprenden los virus de la poliedrosis nuclear y granulosis. El virón de este virus está formado típicamente por ADN y es de forma cilíndrica. Los virus de la granulosis (VG) está formados, también, por un cuerpo de inclusión (0.2-0.5 micras) semejante a gránulos de forma oval o elipsoidal, ocasionalmente, sólo contienen 2 virones (Bustillo, 1984).
En Colombia, hasta la fecha, no existen estudios relacionados con Baculovirus erinnvis, virus de la granulosis en gusano cachón de la yuca (Erinnys ello) y, por ésto, el presente trabajo constituye el primer aporte al conocimiento de este importante agente entomopatógeno. Cuno et al (1981), mencionan que, posiblemente, el virus aislado en Colombia de E. ello sea uno de los de la granulosis de la familia Baculoviridae. De Bach (1964) y Cuno et al (1981) manifiestan, también, que los virus de la granulosis, en su patología, infectan principalmente el cuerpo graso del insecto y, en algunos casos, el epitelio del intestino. A veces, la infección se manifiesta por cambio de color de la cutícula del insecto, como sucede en Pieris rapae en el cual la superficie ventral aparece blanca durante el desarrollo de la enfermedad. El insecto suspende su alimentación y presenta diarrea y su movimiento es lento. A pesar de que la mayoría de los hospederos de estos virus son lepidópteros, se han encontrado algunos hemipteros de los géneros Melolontha y posiblemente Oryctes. Sólo los estados de larva v pupa son altamente susceptibles a los adultos pueden llevar el virus, pero, por lo general, sobreviven al ataque (De Bach, 1964).
Especificidad
Los Baculovirus que pueden reproducirse en más de un hospedero tienen una ventaja considerable sobre aquellos que son monoespecíficos. Estas ventajas están relacionadas con un mayor número de hospederos disponibles para la multiplicación del virus, resultando un incremento del inóculo, lo mismo que una mayor distribución espacial, teniendo un efecto significativo sobre la dinámica de población del virus (Granados, 1986). A pesar de que la especificidad de Baculovirus no ha sido estudiada en detalle, Ignoffo (1968 у 1975) señaló que virus que producen cuerpos ocluidos tienden a ser más específicos con sus hospederos que los que no producen cuerpos ocluidos.
Almacenamiento
Aunque los virus no ocluidos no son estables en largos períodos de almacenamiento, los poliedros son relativamente estables cuando son almacenados, refrigerados, o congelados. Esto lo comprobaron Aizawa (1963) y Jaques (1977) con la significativa actividad de preparaciones de poliedros después de haber estado en refrigeración durante 20 años. Los Baculovirus son menos estables a la temperatura ambiente, pero la mayoría de los poliedros permanecen infectivos por varios años a dicha temperatura (Huger, 1963). David (1975), citado por Granados y Federici (1986), revisó estudios sobre estabilidad y reportó que GV de Pieris brassicae y P. rapae mantuvieron una pequeña actividad después de 1 a 5 años de almacenamiento. Temperaturas por encima de la ambiental dieron como resultado un decrecimiento rápido de la estabilidad del Baculovirus. En general, para los virus de insectos, existen pocas pautas sobre la temperatura óptima de almacenamiento y ésta varía de un investigador a otro. A temperaturas entre 38 y 42°C, perdieron significativamente su actividad en pocos meses o semanas (Lewis et al, 1978; David et al, 1967; Hunter et al, 1973)、a 50°C, la actividad del virus seerde en término de horas o minutos. Cunninghan (1971) adoptó el congelamiento en seco y el material fue almacenado a 4ºC, obteniendo pequeñas pérdidas en la actividad del virus. Chauthani y Clausen (1968), Martignoni (1978) leofilizaron suspensiones de virus que fueron molidas y obtuvieron polvo de finas partículas que empacaron al vacío y almacenaron en sitio seco y fresco y, con ello, su actividad no tuvo pérdidas (por los últimos 5 años). Cualquiera de estas condiciones de almacenamiento mantuvo la actividad de la preparación viral y los niveles de contaminación no se incrementaron.
Pocos estudios se han realizado sobre el efecto de la humedad en la actividad de Baculovirus. Couch e Ignoffo (1981) Jaques (1977), reportados por Granados (1986), resumieron unos hallazgos e indicaron que la estabilidad de preparaciones virales se incrementa a medida que el contenido de humedad disminuye. Sinembargo, se presenta una excepción notable sobre esta generalización, pues David (1975) registró que P. brassicae y P. rapae GV, fueron más estables cuando se almacenaron en ambiente húmedo.
En cuanto a la luz, los Baculovirus son rápidamente inactivados por las ondas cortas y largas de luz ultravioleta (254-310 nanómetros) y las preparaciones no deben se, expuestas a ésta durante ni después de la formulación (Jaques, 1977; Aizawa, 1954; McLeod et al, 1977). David (1975) reportó que P. brassicae GV fue más estable en película húmeda cuando fue expuesta a luz ultravioleta.
Estabilidad En El Campo
Los Baculovirus son rápidamente inactivados por el espectro de la luz ultravioleta de los rayos solares, llegando a tener una vida de 2 o varias horas.
La pérdida de la actividad no es debida a la acción germicida de las ondas cortas del espectro de la luz ultravioleta, ya que en la luz natural del sol existen ondas largas superiores a 290 nm. David (1969), citado por Granados (1986), encontró que la luz ultravioleta de 290 a 320 nm. reduce rápidamente la actividad de P. brassicae GV. Similares resultados han sido reportados con el NPV del H. zea y el NPV de Galeria melonela (Witty Stairs, 1975). Exposición de Baculovirus a radiación con ondas más largas (cerca de 360 mm) tuvieron un pequeño efecto sobre la actividad viral (Witt y Stairs, 1975); Morris, 1971; Bullock et al, 1970.
Aplicacion De Insecticidas Virales
La aplicación de los insecticidas virales ha sido a través de los métodos convencionales de los pesticidas químicos. (Ignoffo, 1970; Yearian y Young, 1978).
Es bien reconocido que la eficacia de los insecticidas virales puede ser incrementada a través del mejoramiento de los métodos de aplicación, pero se han realizado pocos estudios tendientes a mejorar estos métodos. La forma de infección por virus es por la vía oral, por lo cual las aplicaciones deben realizarse de tal manera que se provea una óptima cantidad de virus en los sitios de alimentación y estos sitios pueden diferir de acuerdo con el insecto plaga, la especie de planta hospedera, el estado de desarrollo del insecto huésped, etc. Además, se debe tener en cuenta que, cuando los virus son aplicados a plantas de rápido desarrollo, el nuevo crecimiento quedará libre de virus depositado y, por consiguiente, se requiere repetir las aplicaciones en cortos intervalos de tiempo, con el fin de mantener una cobertura adecuada de la planta (Granados, 1986).
Materiales Y Metodos
El Baculovirus constituyó el material fundamental para la realización de los diferentes estudios presentados en este trabajo y se obtuvo a través del tiempo, desde cuando apareció en colonias de E. ello en 1976 y de él se hicieron renovaciones permanentes. Para la disponibilidad permanente del virus fue necesario mantener una colonia de gusano cachón, la cual se pudo lograr mediante la utilización de jaulas de 1.5 x 1.5 x 1.5 m cubiertas por malla, donde se confinan adultos con plantas de yuca y, así, se obtuvieron huevos y larvas disponibles todo el tiempo. Los adultos, para introducir en las jaulas, se capturaron mediante trampas de luz negra, tipo T20T12BLB.
En otras jaulas iguales a las citadas anteriormente, se aplica el Baculovirus a larvas que están entre tercero y cuarto instar. El virus fue colectado de larvas enfermas y se almacenó en frío entre 3 y 4°C, para su futura utilización. Se prepararon soluciones madres que fueron diluidas, para ser aplicadas en dosis diferentes y evaluar su efectividad en el control de gusano cachón, E. ello.
Proceso para la obtención de Baculovirus en polvo (purificado).
El material viral utilizado en forma impura se extrajo de larvas procedentes del campo y parte de él se purificó y se transformó en polvo.
Preparación de Soluciones Madres
Pesada de larvas muertas por virus.
Macerado o licuado.
Separación de residuos de piel, mediante un tamiz o malla.
El material filtrado, se mezcla con una cantidad de agua conocida, según la concentración que se desea obtener de la solución madre.
Cuando se agregó agua en el tamizado, se tuvo en cuenta la cantidad usada.
Cuando la solución madre se preparó con Baculovirus en polvo (purificado), el procedimiento se redujo a hacer una dilución de éste en la cantidad de agua requerida, para llegar a la concentración deseada. A partir de estas concentraciones, se pueden usar las dosis que se deseaban evaluar para determinar el efecto del patógeno sobre la plaga.
En la Figura 1, se puede apreciar el esquema de uno de los métodos utilizados para la purificación del Baculovirus. El método implementado por Upali Jayasinghe se basa principalmente en un proceso de centrifugación y digestión de proteínas con cloroformo. En la fotografía 1, se puede apreciar al microscopio electrónico un cuerpo ocluido aumentado 50.000 X, obtenido después de la purificación.
Varios ensayos fueron realizados para determinar la eficiencia del Baculovirus erinnyis en el control de E. ello. El primero se realizó en 1980, en Santander de Quilichao en la granja del CIAT, aprovechando una alta incidencia de la plaga en varios lotes (promedio de 32 larvas/planta). Se marcaron parcelas de 36 plantas con 4 repeticiones y 2 tratamientos o dosis para evaluar: 5 cc de Baculovirus 30% por litro de agua y 10 cc de la misma solución. Después de 72 horas de aplicado el patógeno, se hizo una recolección al azar de 20 larvas por parcela y tratamiento. Se llevaron al laboratorio, donde se les suministró alimento y se observó sintomatología y mortalidad.
Otro ensayo, a nivel de laboratorio (25°C HR), se realizó con el mismo objetivo, ofreciendo follaje aplicado de Baculovirus a larvas en bandejas plásticas de 35 cm x 20 cm x 15 cm. En cada bandeja se introdujeron 10 larvas de primer instar, con 5 repeticiones para un total de 50 larvas evaluadas por tratamiento. En cada ensayo se colocó su correspondiente testigo.
Un tercer ensayo se llevó a cabo en los campos de CIAT-Palmira en 1985, con el fin de evaluar el control de E. ello con Baculovirus después de haber sido almacenado por períodos de 2-4 años, en diferentes condiciones físicas: puro e impuro. En la Tabla 1, se pueden apreciar las soluciones madres, preparaciones y dosis aplicadas en todos los ensayos.
Cuerpo viral ocluido de Baculovirus erinnyis, aumentada 50.000 X al microscopio electrónico. CIAT 1984.
Baculovirus erinnyis soluciones madres y dosis usadas para el control de E. ello.
Tipo de Virus
Solución Madre (%)
Preparación
Dosis Aplicada
Recién colectado Impuro de 2 meses en frío
30
300 gr. larvas en 700 cc. de agua
5 y 10 cc/lt. de agua
6
30 gr. larvas en 470 cc. de agua
10 cc/litro de agua
Liofilizado (Polvo) Puro 2 años al ambiente
0.26
0.13 gr. polvo en 50 cc. de agua
10 cc/litro de agua
Viejo - Impuro 4 años en frío
6
30 gr. larvas en 470 cc. de agua
10 cc/litro de agua
Los diferentes tratamientos aplicados se hicieron a surcos de 40 m de longitud, donde se marcaron 15 plantas al azar para ser observadas en cada evaluación. Entre cada surco tratado se dejaron como barrera 20 surcos de por medio. Las evaluaciones se hicieron a las 0 - 41 - 89 - 113 y 161 horas.
Resultados Y Discusion
En el primer ensayo realizado en Santander de Quilichao, con las dos dosis utilizadas, a las 72 horas después de la aplicación y cuando se hizo la recolección de larvas se observó mortalidad en el campo y, a las 120 horas después de la aplicación, hubo mortalidad del 100%. En las bandejas donde se colocaron las larvas colectadas en las parcelas sin aplicación del virus, no se presentó mortalidad alguna.
Con estos resultados se obtuvieron los primeros indicios de la posibilidad de utilizar el Baculovirus erinnyis para el control de gusano cachón. También, se observó la facilidad con que se puede aplicar este patógeno utilizando los métodos convencionales. Es importante destacar que en la solución preparada no queden partículas (piel y residuos del insecto) que puedan obstruir las boquillas de las bombas de aplicación.
En el ensayo de laboratorio, cuando se ofreció follaje asperjado con el Baculovirus a las larvas en primer instar, cuyos resultados se pueden observar en la Tabla 2, se aprecia la diferencia en el porcentaje de mortalidad entre el testigo y los dos tratamientos con Baculovirus después de 48 y 72 horas de la aplicación. Cuando se aplicaron 10 cc de Baculovirus, 30% por litro de agua, la mortalidad fue más rápida (100% a las 72 horas) que cuando se usaron 5 cc (100% de mortalidad a las 96 horas). A las 48 horas hubo diferencia significativa entre las dos dosis, pero a las 72 horas no. En la Figura 2 se puede apreciar que la cantidad de larvas sanas en estos períodos es 0. Al final, el testigo presentó un porcentaje de mortalidad del 30%, posiblemente, debido al manipuleo en el laboratorio.
En este ensayo comparado con el primero, la mortalidad ocurrió en un período menor (48-96 horas vs. 72-120 horas), debida, posiblemente, a que el follaje consumido por las larvas en confinamiento estuvo bien cubierto por el virus, mientras que, en el campo, no se presentó esta misma situación. Esto resalta la importancia de hacer un mayor cubrimiento con la solución viral a nivel de campo o realizar, según la situación, aplicaciones a intervalos más cortos, como indica Granados (1986).
Control de Erinnyis ello con Baculovirus (NGV).
Dosis por litro de agua
Tiempo horas
No, larvas sanas
No, larvas muertas por virus
% mortalidad acumulado
5 cc
0
50
0
0 A
48
27
23
46 C
72
4
23
92 BB
96
4
4
100 BB
10 cc
0
50
0
0 A
48
9
41
82 BB
72
0
9
100 BB
Testigo 0 cc
0
50
0
0 A
48
50
0
0 A
72
46
4
8 A
96
35
11
30 C
Nivel de significancia al 005.
Control de Erinnyis ello con Baculovirus (NGV).
En el tercer ensayo se utilizaron: Baculovirus almacenado impuro (4 años) entre 3 y 4°C, puro (liofilizado) al ambiente durante 2 años e impuro recién colectado (menos de 2 meses de almacenamiento en frío) aplicados en el campo. La Figura 3 indica que los resultados más efectivos para el control de E. ello, aplicando Baculovirus, en todos los períodos evaluados, fueron cuando se utilizó material con menor tiempo de almacenamiento, seguido de aquel con 4 años (1-4A-F) e impuro. En el Baculovirus puro (P-2A-A), su efecto se empezó a notar a las 89 horas (0.40/0 mortalidad) y su virulencia fue menor, pues, cuando en el impuro la mortalidad llegó al 100%, en éste, el máximo alcanzado fue 27.2%.
Esta situación pudo deberse a la concentración utilizada en la solución madre, 0.26% comparada con 6% para los otros dos tratamientos, aunque las dosis utilizadas fueron iguales (10 cc soluc./litro agua) Tabla 1. En el surco testigo, en ninguno de los períodos evaluados se presentó mortalidad de larvas.
Es importante resaltar en este ensayo, que todos los sistemas utilizados arrojaron resultados positivos en mayor o menor grado para el control de E. ello. Estos resultados de almacenamiento y control tienen concordancia con los obtenidos por Cunninham (1971), Chauthani y Clausen (1968) y Martignoni(1978), reportados por Granados (1986).
En el tercer ensayo, fue evaluado, también, el parasitismo de huevos en las plantas y el comportamiento de éste puede verse en la Figura 4, donde se aprecia que las aplicaciones de Baculovirus tampoco tienen efecto negativo sobre el parasitismo de huevos, ya que la tendencia de éste en cada uno de los tratamientos fue el de aumentar y fluctuó entre 20 y 40% inicialmente (a las 0 horas) hasta 58 y 82% (a las 161 horas).
Es necesario anotar que, en Brasil, actualmente, se ha adoptado por parte de las entidades nacionales esta metodología sencilla para el control de E. ello y se ha logrado su objetivo con mucho éxito teniendo gran aceptación entre los cultivadores de yuca y se está implementando para ser utilizada en Colombia.
Síntomas característicos de larvas de E. ello atacadas por Baculovirus erinnyis.
Las larvas de color negro se tornan brillosas en su superficie dorsal y la cutícula pierde su apariencia oscura (textura como de pana) y se torna más lisa y clara.
Las larvas de color amarillo y verde se tornan más claras y, a través de la cutícula, se aprecia una coloración lechosa como coágulos, al mismo tiempo, aparecen manchas color marrón entre los pliegues de los segmentos. Al pincharlas con algún objeto punzante, las larvas emanan un líquido lechoso, semejante al latex.
Las larvas se vuelven lentas en su actividad y dejan de alimentarse.
Presentan diarrea y los últimos excrementos pueden quedarse adheridos al segmento anal.
Las larvas se tornan rugosas y pueden colgarse de los pecíolos de las hojas o morir sobre la superficie de las mismas o sobre el tallo.
Después de cierto tiempo, se produce descomposición por contaminación y las larvas se revientan produciéndose un olor desagradable.
Porcentaje de larvas muertas por Baculovirus erinnyis.
Comportamiento del parasitismo de huevos de E. ello en parcelas tratadas con Baculovirus erinnyis.
Conclusiones
El virus B. erinnyis, que ataca al gusano cachón E. ello, puede ser obtenido de larvas enfermas y ser utilizado como insecticida biológico.
Según la concentración de la solución madre, las condiciones de almacenamiento y la dosis aplicada, el B. erinnys puede producir la muerte de las larvas de cachón entre las 41 y 160 horas después de aplicado.
B. erinnyis en estado impuro puede ser almacenado entre 2 y 4°C por más de 4 años sin perder su viabilidad.
De acuerdo con los resultados obtenidos, el virus es más eficaz cuando se aplica recién obtenido de larvas en fermas.
En esta investigación, el virus arrojó resultados positivos en todas las concentraciones, dosis y formas en que se usó.
B. erinnyis es un agente biológico, que puede ser extractado fácilmente por cualquier agricultor.
B. erynnyis no tiene un efecto negativo sobre los parásitos de huevo de E. ello.
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