Relationship between Content of Limonin in Citrus Waste and Antifeedant Activity against Spodoptera Frugiperda

Abstract

In this study was quantified limonin in ethanol extracts of citrus waste (peels and seeds) of two species (C. limonia and Citrus sinensis) and their fractions in n- hexane, dichloromethane, ethyl acetate and water by HPLC. Antifeedant activity assays measured through several antifeedant indices to the respective extracts (dicloromethane fractions) were carried on Spodoptera frugiperda. In addition, a relationship between the content of limonin and the treatments was established. The dicloromethane fractions from seeds of C. sinensis and C. limonia had a higher yield of limonin (1.86 ppm and 1.35 ppm, respectively) and greater antifeedant activity. The linear regression analysis showed that the bioactivity, as measured by the indices, is directly related to the content of limonin on each treatment. The results are promising in terms of the use of citrus waste metabolites as potential control agents of S. frugiperda.

Introducción

Numerosos limonoides (Fig. 1) provenientes de las familias Meliaceae, Labiatae y Rutaceae han recibido especial aten-ción debido a que actúan como antialimentarios, toxinas y reguladores del crecimiento de insectos plaga (Morgan 2009; Ambrozin et al. 2006; Silva et al. 2006). En el caso específi-co de las rutáceas de interés comercial, estos compuestos se encuentran presentes principalmente en semillas, las cuales luego de procesos agroindustriales se convierten en residuos que representan un problema ambiental y económico debido a que son dispuestos de forma inadecuada y su eliminación es costosa (Alfonso et al. 2010).

Estudios recientes sobre estos compuestos han resaltado la importancia de los más de 300 limonoides naturales ais-lados con características estructurales complejas, diversifi-cadas y con alta actividad biológica (Caballero 2004; Isman 2006; Roy y Saraf 2006); específicamente los limonoides cí-tricos, obtenidos de residuos agroindustriales (cáscaras y se-millas) han presentado actividad antialimentaria significativa a bajas concentraciones frente a lepidópteros, coleópteros y dípteros, entre otros insectos plaga (Bilal et al. 2012; Hafeez et al. 2011; Ruberto et al. 2002).

En el caso específico de los lepidópteros, un estudio que evaluó los extractos de semillas y cáscaras de C. sinensis y C. limonia, encontró que aquellos etanólicos y fracciones en diclorometano de residuos cítricos, presentaban actividad an-tialimentaria sobre Spodoptera frugiperda J. E. Smith, 1797 (Lepidoptera: Noctuidae) (Jiménez et al. 2013). Por lo ante-rior esta investigación tuvo como objetivo determinar la re-lación entre el contenido de limonina de los extractos y frac-ciones diclorometánicas, de residuos de dos especies cítricas (C. sinensis y C. limonia), y su relación con la actividad an-tialimentaria sobre S. frugiperda, medida a través de pruebas de preferencia, no preferencia, y el establecimiento de índices antialimentarios y antinutricionales, para establecer el poten-cial de los residuos cítricos aquí evaluados como materia pri-ma para la obtención y formulación de un producto eficaz y de bajo impacto ambiental para el control de S. frugiperda y po-tencialmente a otros lepidópteros de importancia económica.

Materiales y métodos

Tratamiento del material vegetal. Se recolectaron residuos agroindustriales (cáscaras y semillas) de C. sinensis prove-niente de la zona urbana de Ibagué (Tolima-Colombia) y C. limonia del municipio de Prado Tolima (3°46'40,40″N 74°57'31,52"O). Cada tipo de residuo se secó a 45°C duran-te 72 horas y se pasó por un molino eléctrico Thomas Wiley. Del material homogenizado con un tamiz de 2 mm de poro, se empacaron 170 g de cada tipo en un dedal de interlón y se realizó un desengrasado con n-hexano en un equipo soxhlet hasta el agotamiento. El exceso de n-hexano fue retirado a 35 ± 2 °C y, nuevamente, sometido a reflujo en soxhlet con etanol al 96%. Los extractos etanólicos (crudos) fueron con-centrados a presión reducida en un rotavapor BUCHI R114 y cada uno fue fraccionado líquido-líquido colocando 50 mL y agregándole la misma cantidad de n-hexano, diclorometano (DCM), acetato de etilo y agua sucesivamente, hasta obtener de cada extracto crudo las fracciones correspondientes a los solventes mencionados.

Caracterización y cuantificación de la limonina. A cada uno de los extractos y fracciones purificadas se les realizó una identificación preliminar de limonina utilizando cromatogra-fía de capa delgada (CCD) usando limonina (Sigma Aldrich®) como referencia. Las muestras seleccionadas en función de la presencia de limonina, se cuantificaron por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), en un equipo Agilent Technologies serie 1200, con detector de arreglo de diodos, bajo las siguientes condiciones: longitud de onda de 210 nm, columna C18 de 2x150 mm (diámetro de partícula de 5µm), flujo de 0.5 ml/min, volumen de inyección 20 µl, tempera-tura de corrido 25 °C, fase móvil acetonitrilo:agua para los extractos y fracciones de semillas y acetonitrilo:buffer acido fórmico pH 2,73 para los extractos y fracciones de cáscaras, en gradiente 30-80% durante 15 minutos con una fase de estabilización de 100% acetonitrilo durante 15 minutos. La curva de calibración se realizó con limonina Sigma Aldrich de pureza HPLC > 95% a una concentración de 5, 10, 20, 30 y 40 ppm (Fig.1).

Figura 1.

Estructura química de la limonina. Fuente: Los autores.

Actividad antialimentaria. Se realizaron ensayos anti-alimentarios sobre larvas de 120 ± 10 mg de una colonia de S. frugiperda establecida en condiciones de laboratorio a partir de posturas proporcionadas por la Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB) de Medellín. Los ensayos se efectuaron en condiciones de preferencia (con posibilidad de elección) y no-preferencia (sin posibilidad de elección) con discos foliares de Ricinus communis tratados con 10 µL de soluciones del 0,25, 0,5, 0,75 al 1% de los extractos etanólicos crudos y la fracción diclorometánica de cada re-siduo y sin tratar con 10µL de agua o el solvente usado en la dilución. Los extractos crudos se suspendieron en agua mientras que la fracción diclorometánica en una mezcla diclorometano:agua en proporciones (1:4) (Caballero 2004; Jiménez et al. 2013); se tomaron los datos del peso inicial de los discos foliares en fresco (antes y al final del ensayo); el peso final seco del disco foliar se obtuvo luego de 12 horas de secado a 60 ± 5 °C.

Con el fin de evidenciar la relación entre la limonina y los resultados obtenidos, se realizaron ensayos con el limonoide a 10 y 50 ppm teniendo en cuenta las condiciones utilizadas en los ensayos anteriormente mencionados.

Ensayos de preferencia. Discos foliares tratados con la limo-nina y control (sin tratamiento), se alternaron dentro de cada caja de Petri de forma que el insecto pudiera elegir. El ensayo se dio por finalizado trascurridas cinco horas desde el inicio del ensayo o cuando la larva hubiese ingerido el 50% de los discos foliares. Con la información del consumo de discos fo-liares se calculó por cada larva el índice disuasorio (ID) así:

ID = [(C-T)/(C+T)] x 100% donde: C= consumo de discos foliares testigo y T = consumo de discos foliares tratados (Blaney et al. 1988; Jiménez et al. 2013).

Ensayos de no preferencia. En situaciones de no-elección se colocó en una caja de Petri un disco foliar impregnado con la limonina en solución acetonitrilo:agua (1:4). El ensayo fina-lizó cuando las larvas ingirieron el 50% del disco foliar en las cajas de Petri testigo o a las cinco horas de transcurrido el en-sayo. Con los datos del consumo de discos foliares se calculó el índice antiapetitivo (IA) mediante la siguiente ecuación:

IA = [(C-T)/C] x 100%

donde: C= ingestión de discos foliares testigo y T = ingestión de discos foliares tratados (Blaney et al. 1988; Jiménez et al. 2013).

Análisis estadístico. Los datos obtenidos se analizaron me-diante un diseño experimental 2x2 con 10 réplicas para el índice antiapetitivo y cinco réplicas para el índice disuasorio, en el que se evaluaron las variables tratamiento (cuatro ex-tractos, sus fracciones diclorometánicas) y su dosificación. Se verificó la normalidad de los datos mediante la prueba de bondad de ajuste de Kolmogorov-Smirnov; se realizó un aná-lisis de varianza ANOVA de dos vías; usando el test de Tukey para las comparaciones múltiples, la información fue proce-sada con el programa Infostat versión libre 2008.

Para determinar la relación entre la actividad y la concen-tración de la limonina, se realizaron análisis de regresión sim-ple relacionando los índices antialimentarios en función del contenido de limonina en los extractos y fracciones mediante el programa Statgraphics Centurion XV versión 15.2.06. Se determinó el p valor del modelo y el intercepto, se calculó el error estándar del estimado, el error absoluto medio (MAE) y el estadístico de Durbin-Watson (DW) para determinar si existió correlación significativa entre ellos.

Resultados y discusión

Cuantificación de limonina. Las muestras con mayor ren-dimiento de limonina fueron las fracciones diclorometáni-cas obtenidas de semillas de C. sinensis y C. limonia con 1,86 ppm y 1,35 ppm, seguidas del extracto etanólico de C. limonia con 0,204 ppm de limonina en relación peso/peso con la materia seca de cada residuo; de esta manera las frac-ciones diclorometánicas de semillas mostraron mayor efec-to antialimentario, tal como lo habían reportado Jiménez et al. (2013). Estos resultados se lograron correlacionar con la cantidad de limonina presente y el incremento en la ac-tividad de las fracciones diclorometánicas guardó relación directa con la concentración de la limonina indicando que es el principal metabolito activo en las muestras evaluadas; lo cual es consistente con otros estudios, en los cuales se demostró que este limonoide tiene acción anti-apetitiva y disuasoria de la alimentación (Ruberto et al. 2002; Vikram et al. 2007).

El porcentaje de limonina de cada uno de los extractos y co-rrespondientes fracciones diclorometánicas, mostró que las semillas son el tipo de residuo con mayor contenido de este limonoide, lo que concuerda con los resultados obtenidos por Manners et al. (2003) y Manners y Breksa (2004). Igual-mente se realizó la cuantificación de limonina en semillas y cáscaras de C. limonia, comparándola bajo el mismo méto-do cromatográfico usado para Citrus sinensis (Vikram et al. 2007) mostrando al diclorometano como un solvente adecua-do para la extracción de metabolitos de naturaleza limonoide en los extractos crudos.

La limonina, presentó relación directa estadísticamente significativa con la actividad disuasoria, lo que se evidencia en el análisis de regresión lineal del índice disuasorio (Tabla 1). Lo anterior se aplicó para los extractos etanólicos de semi-lla de naranja y cáscaras de naranja y limón, y las fracciones diclorometánicas de cáscara de naranja, semillas de limón y semillas de naranja, exceptuando el extracto etanólico de semillas de limón y la fracción en diclorometánica de cásca-ras de limón, que en este caso no evidenciaron una relación estadísticamente significativa entre dicha actividad y la con-centración de limonina (Tabla 1). Desde el punto de vista de la composición química, esto podría mostrar que la actividad biológica puede estar influenciada por sinergismos con otros compuestos de naturaleza limonoide, tales como nomilina y obacunona los cuales han sido reportados en cítricos (Bilal et al. 2012; Ruberto et al. 2002; Vikram et al. 2007); en este caso, la fracción en DCM de semilla de naranja, mostró la mayor actividad disuasoria relacionada directamente con la concentración de la limonina, con un coeficiente de corre-lación de 0,9603, observación que se reafirma con el valor del estadístico r-cuadrado del modelo ajustado que explicó el 92,22% de variabilidad.

Tabla 1.

Análisis de regresión lineal del índice disuasorio vs concentración de la limonina en extractos etanólicos y fracciones diclorometánicas.

Muestra	Concentración del extracto (%)	Concentración limonina (mg/extracto seco)	% índice antiapetitivo	Coeficiente de correlación	Valor p del modelo
SN	0,25	6,00x10−04	14,68	0,994	0,0057
	0,5	1,20x10−03	30,64
	0,75	1,80x10−03	57,67
	1	2,40x10−03	64,61
SL	0,25	1,53x10−01	15,00	0,992	0,0078
	0,5	3,05x10−01	23,04
	0,75	4,58x10−01	33,8
	1	6,10x10−01	47,98
CL	0,25	2,50x10−05	28,94	0,952	0,0479
	0,5	5,00x10−05	31,83
	0,75	7,50x10−05	35,69
	1	1,00x10−04	42,44
SND	0,25	4,45x10−02	33,95	0,995	0,0047
	0,5	8,90x10−02	58,65
	0,75	1,34x10−01	82,12
	1	1,78x10−02	97,87
SLD	0,25	1,78x10−02	64,1	0,992	0,0083
	0,5	3,55x10−02	74,2
	0,75	5,33x10−02	79,65
	1	7,10x10−02	86,54
CLD	0,25	7,50x10−04	42,3	0,936	0,0643*
	0,5	1,50x10−04	46,65
	0,75	2,25x10−04	52,35
	1	3,00x10−04	62,94

*

Indica que el modelo no es estadísticamente significativo a un nivel de confianza de 95%. SN: Extracto etanólico semillas de naranja; SL: Extracto etanólico semillas de limón; CL: Extracto etanólico cáscaras de limón; SND: fracción diclorometánica semillas de naranja; SLD: fracción diclorometánica semilla de limón; CLD: fracción diclorometánica cáscaras de limón.

La comparación gráfica de los valores estimados calcu-lados para el índice antialimentario, frente a la concentra-ción de limonina, cuando ésta es igual a 50 ppm muestra de igual forma que la fracción en diclorometano de cásca-ras de limón, presentó un mayor índice antiapetitivo que la limonina pura (Tabla 2); esto de nuevo conduce a supo-ner que existen compuestos activos diferentes a la limoni-na que pueden actuar de manera conjunta potenciando la bioactividad sobre S. frugiperda; por tal motivo el uso de extractos a base de residuos cítricos se convierte en una alternativa para el control de insectos plaga. Es de aclarar que los demás extractos y fracciones presentan una rela-ción estadísticamente significativa con el contenido de li-monina (Tabla 3).

Tabla 2.

Índice antiapetitivo, disuasorio y tasa de incremento de peso (TIP) de limonina (Sigma Aldrich®) sobre larvas de S. frugiperda.

Concentración limonina pura (ppm)	Índice antiapetitivo %	Índice disuasorio%	Tasa incremento de peso
BLANCO	0	0	4,3x10−02
10	27,68	60,51	-1,8x10−03
50	46,59	104,33	-3,8x10−03

Tabla 3.

Análisis de regresión lineal del índice antiapetitivo vs concentración de la limonina presente en extractos etanólicos y fracciones diclorometánicas.

Muestra	Concentración del extracto (%)	Concentración de la limonina (mg/extracto seco)	Índice disuasorio %	Coeficiente de correlación	Valor P del modelo
SN	0,25	6,0x10−04	15,54	0,959	0,0410
	0,5	1,2x10−03	55,75
	0,75	1,8x10−03	86,52
	1	2,4x10−03	190,12
SL	0,25	1,5x10−01	0,71	0,842	0,1585*
	0,5	3,1x10−01	3,47
	0,75	4,6x10−01	7,17
	1	6,1x10−01	49,63
CL	0,25	2,5x10−05	0,86	0,945	0,0548
	0,5	5,0x10−05	1,25
	0,75	7,5x10−05	3,80
	1	1,0x10−04	7,77
SND	0,25	4,5x10−02	44,12	0,960	0,0397
	0,5	8,9x10−02	105,12
	0,75	1,3x10−01	126,10
	1	1,8x10−02	239,08
SLD	0,25	1,8x10−02	19,98	0,959	0,0410
	0,5	3,6x10−02	36,55
	0,75	5,3x10−02	52,67
	1	7,1x10−02	99,99
CLD	0,25	7,5x10−04	7,95	0,884	0,1159*
	0,5	1,5x10−04	15,50
	0,75	2,3x10−04	20,20
	1	3,0x10−04	44,79

*

Indica que el modelo no es estadísticamente significativo con un nivel de confianza de 95%. SN: Extracto etanólico semillas de naranja; SL: Extracto etanólico semillas de limón; CL: Extracto etanólico cáscaras de limón; SND: fracción diclorometánica semillas de naranja; SLD: fracción diclorometánica semilla de limón; CLD: fracción diclorometánica cáscaras de limón.

La aplicación del coeficiente de correlación a los resulta-dos obtenidos de la tasa de incremento de peso (Jiménez et al. 2013), indicó que existe una relación estadísticamente signi-ficativa entre las dos variables tasa de incremento de peso y concentración de limonina (Tabla 4), lo que se traduce en un efecto dosis dependiente entre la limonina y la disminución de la tasa de incremento de peso de las larvas. Estos resulta-dos concuerdan con resultados de Ruberto et al. (2002) con la limonina, mostrando así la actividad tóxica de este limonoide sobre larvas de S. frugiperda. En este caso las fracciones en diclorometano de semillas de limón y cáscaras de limón no presentaron una relación directa con el contenido de limonina ya que presentaron un valor P > 0,05 y un R2 < 90% indicando nuevamente la interacción entre compuestos diferentes a la limonina (Tablas 1, 3 y 4).

Tabla 4.

Análisis de regresión lineal de la tasa de incremento de peso vs concentración de limonina.

Muestra	Concentración del extracto (%)	Concentración de la limonina (mg/extracto seco)	% tasa de incremento de peso	Coeficiente de correlación	Valor P del modelo
SN	0,25	6,00x10−04	5,8x10−04	0,958	0,0101
	0,5	1,20x10−03	-2,6x10−03
	0,75	1,80x10−03	-3,9x10−03
	1	2,40x10−03	-6,5x10−03
SL	0,25	1,53x10−01	2,5x10−03	0,954	0,0118
	0,5	3,05x10−01	6,6x10−04
	0,75	4,58x10−01	-7,5x10−04
	1	6,10x10−01	-2,6x10−03
CL	0,25	2,50x10−05	8,2x10−04	0,925	0,0244
	0,5	5,00x10−05	1,6x10−03
	0,75	7,50x10−05	-4,3x10−04
	1	1,00x10−04	-4,1x10−03
SND	0,25	4,45x10−02	2,4x10−03	0,983	0,0026
	0,5	8,90x10−02	8,1x10−04
	0,75	1,34x10−01	-2,2x10−03
	1	1,78x10−02	-5,2x10−03
SLD	0,25	1,78x10−02	-4,2x10−03	0,869	0,0559*
	0,5	3,55x10−02	-6,5x10−03
	0,75	5,33x10−02	-8,5x10−03
	1	7,10x10−02	-1,0x10−02
CLD	0,25	7,50x10−04	-4,1x10−04	0,780	0,1194*
	0,5	1,50x10−04	-3,2x10−03
	0,75	2,25x10−04	-7,7x10−03
	1	3,00x10−04	-1,0x10−02

*

Indica que el modelo no es estadísticamente significativo con un nivel de confianza de 95%. SN: Extracto etanólico semillas de naranja; SL: Extracto etanólico semillas de limón; CL: Extracto etanólico cáscaras de limón; SND: fracción diclorometánica semillas de naranja; SLD: fracción diclorometánica semilla de limón; CLD: fracción diclorometánica cáscaras de limón.

Conclusión

La evaluación del contenido de limonina presente en residuos cítricos y la determinación de la relación directa que existe entre compuestos de naturaleza limonoide y la actividad an-tialimentaria sobre S. frugiperda, sugieren un potencial uso y aprovechamiento de estos residuos, considerados en la actua-lidad como material de desecho. Esto abre la posibilidad de usar extractos ricos en limonoides para el control de lepidóp-teros de importancia económica, a través de la implementa-ción de bioinsumos que se articulen a programas de manejo integrado de plagas (MIP).